遠(yuǎn)志皂苷調(diào)節(jié)線粒體自噬在抗Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、中藥遠(yuǎn)志（Polygalae radix）具有抗癡呆、腦保護(hù)、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、保護(hù)心腦血管等作用，其主要活性成分細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（tenuifolin，Ten）可通過多種途徑發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，具有抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抑制細(xì)胞凋亡、增進(jìn)認(rèn)知等作用，還可通過自噬途徑減少AD模型細(xì)胞Aβ的分泌。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Ten可通過降低ROS、MDA并提高SOD、GSH-Px濃度或活性，減輕Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷；通過上調(diào)Bcl-2/Bax比值，抑

2、制caspase凋亡蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率；通過調(diào)控RAGE、LRP1蛋白表達(dá)，改善Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)及清除能力；通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平，防止神經(jīng)細(xì)胞周期紊亂，從而對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。目前，隨著Ten的神經(jīng)保護(hù)作用的研究不斷深入，其作用的分子機(jī)制及相關(guān)的信號通路的研究仍有待進(jìn)一步闡明。本論文探討了Ten通過調(diào)節(jié)線粒體自噬在抗Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制，闡明其調(diào)節(jié)線粒體自噬作用的信號途徑，為進(jìn)一步研究細(xì)胞自噬在

3、Ten抗阿爾茨海默病中的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體內(nèi)容如下：
　　1.Ten對Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力和凋亡率的作用研究。MTT法檢測細(xì)胞活力，25、50μM的Ten能顯著增加細(xì)胞活力，Aβ顯著降低細(xì)胞活力的最小劑量是20μM， Ten（25-200μM）組細(xì)胞活力顯著高于Aβ（20μM）模型組，其中50、100μM劑量的Ten具有最佳的保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果表明，Ten50、100μM處理組都明顯降低了Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y

4、細(xì)胞凋亡率，其中50μM劑量的Ten作用最顯著，選用50μM的Ten及20μM的Aβ用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.Ten對Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體損傷的作用研究。JC-1檢測Δψm的變化，Δψm較高時(shí)，JC-1聚集形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光，否則產(chǎn)生綠色熒光，Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞紅色熒光明顯降低，綠色熒光明顯增加，紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變比較明顯；而經(jīng)Ten和CsA處理后，紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變的趨勢被抑制。Western

5、 blot檢測Cyt c的變化，Ten和CsA組能明顯抑制Aβ誘導(dǎo)的Cyt c的蛋白表達(dá)。caspase-3和caspase-9酶活力的測定及qPCR法檢測其mRNA的表達(dá)水平，Ten和siRNA組明顯抑制了Aβ誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，Ten和CsA或siRNA組可明顯抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞Δψm降低、Cyt c釋放、caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表達(dá)增加。

6、r>　　3.Ten對Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬作用及機(jī)制的研究。MDC染色觀察Ten處理組明顯減弱了Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。Western blot檢測自噬標(biāo)志性蛋白LC3的變化，Ten和CsA組明顯抑制了Aβ誘導(dǎo)的LC3-II/I的增加。MTG和LTR染色檢測細(xì)胞線粒體溶酶體共定位情況，Ten、CsA和Ten+CsA組明顯抑制了Aβ誘導(dǎo)紅綠熒光共定位增加。qPCR法檢測PINK1和Parkin的mRNA的

7、表達(dá)水平， Ten和siRNA組明顯抑制了Aβ誘導(dǎo)PINK1和Parkin mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，Ten和CsA或siRNA組可抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬體、LC3-II/I及線粒體自噬的增加。
　　綜上所述，Ten能增強(qiáng)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率；減少線粒體損傷，增加Δψm并減少Cyt c的釋放，抑制caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表達(dá)；降低自噬小體及LC3-II/I蛋白表達(dá)和線粒體溶酶體共定