線粒體損傷對囊腫襯里上皮細胞初級纖毛結構與功能的影響.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在探索常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystickidney disease，ADPKD)中是否存在線粒體損傷，并探討線粒體損傷對初級纖毛結構和功能的影響及其可能機制，以進一步了解纖毛致病假說，并提供干預多囊腎病的新靶標。
　　實驗方法:
　　1.多囊腎病中線粒體損傷的生物學驗證
　　(1)采用Western-blot及Real-time PCR方法檢

2、測多囊腎病動物模型pkd1-/-小鼠及正常對照pkd1+/+小鼠腎臟中、人多囊腎囊腫襯里上皮細胞(WT9-12)及正常腎小管上皮細胞(RCTEC)中熱休克蛋白75(Heat shock protein75，HSP75)、線粒體內膜移位酶44(Translocases of the inner membrane44，Tim44)、線粒體外膜移位酶20(Translocases of the outer membrane20，Tim20)、

3、細胞色素C的表達差異。
　　(2)采用透射電鏡觀察WT9-12及RCTEC中線粒體的結構形態(tài)差異。
　　2.多囊腎病中初級纖毛結構及功能異常的生物學驗證
　　(1)采用Western-blot方法檢測pkd1-/-小鼠及pkd1+/+小鼠腎臟中、WT9-12及RCTEC中驅動蛋白2(Kinesin2)、IFT88的蛋白水平表達差異。
　　(2)采用Real-time PCR方法檢測WT9-12及RCTEC中Kin

4、esin2的表達差異。
　　(3)采用透射電鏡、免疫熒光方法觀察WT9-12及RCTEC中初級纖毛結構差異。
　　3.HSP75對線粒體功能及初級纖毛結構和功能的影響研究
　　(1)采用Western-blot方法檢測WT9-12中轉染質粒過表達HSP75后TIM44、TOM20、細胞色素C、Kinesin2、IFT88的表達差異。
　　(2)采用Western-blot方法檢測RCTEC中siRNA干擾下調HS

5、P75表達后TIM44、TOM20、細胞色素C、Kinesin2、IFT88的表達差異。
　　(3)采用化學發(fā)光法檢測WT9-12中轉染質粒過表達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調HSP75表達后細胞內ATP含量的變化。
　　(4)采用MTT法觀察WT9-12中轉染質粒過表達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調HSP75表達后細胞增殖的變化。
　　(5)采用激光共聚焦方法觀察WT9-12中轉染質粒過表

6、達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調HSP75表達后初級纖毛結構的變化。
　　(6)采用流式細胞術方法檢測WT9-12中轉染質粒過表達HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調HSP75表達后細胞內鈣離子濃度變化。
　　結果:
　　1.Westem-blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)pkd1-/-小鼠腎臟中HSP75、TIM44、TOM20表達較pkd1+/+小鼠減少，細胞色素C表達增多，WT

7、9-12中得到相同結果。
　　2.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)與RCTEC比較，WT9-12中線粒體形態(tài)明顯腫脹，線粒體嵴消失。
　　3.免疫熒光發(fā)現(xiàn)與RCTEC比較，WT9-12中初級纖毛數量變少，長度變短甚至消失。
　　4.WT9-12轉染質粒過表達HSP75后TIM44、TOM20表達上調，細胞色素C表達下調，Kinesin2、IFT88表達上調。
　　5.RCTEC siRNA干擾下調HSP75表達后TIM44、TO

8、M20表達下調，細胞色素C表達上調，Kinesin2、IFT88表達下調。
　　6.化學發(fā)光法檢測ATP發(fā)現(xiàn)WT9-12轉染質粒過表達HSP75后細胞內ATP量明顯減少。RCTEC siRNA干擾下調HSP75表達后細胞內ATP量明顯增加。
　　7.MTT法檢測發(fā)現(xiàn)WT9-12轉染質粒過表達HSP75后促進細胞增殖，RCTEC siRNA干擾下調HSP75表達后抑制細胞增殖。
　　8.激光共聚焦發(fā)現(xiàn)WT9-12轉染質粒

9、過表達HSP75后初級纖毛長度變長，RCTEC siRNA干擾下調HSP75表達后初級纖毛長度明顯變短。
　　9.WT9-12轉染質粒過表達HSP75后細胞內鈣離子濃度無明顯差異，RCTEC siRNA干擾下調HSP75表達后72小時細胞內鈣離子濃度明顯減低。
　　結論:
　　本研究結果表明，多囊腎病模型鼠腎臟及人多囊腎囊腫襯里上皮細胞中存在線粒體損傷，且初級纖毛的結構和纖毛內轉運功能存在異常，線粒體損傷可能通過能量代