線粒體損傷對(duì)囊腫襯里上皮細(xì)胞初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)與功能的影響.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在探索常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystickidney disease，ADPKD)中是否存在線粒體損傷，并探討線粒體損傷對(duì)初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響及其可能機(jī)制，以進(jìn)一步了解纖毛致病假說(shuō)，并提供干預(yù)多囊腎病的新靶標(biāo)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.多囊腎病中線粒體損傷的生物學(xué)驗(yàn)證
　　(1)采用Western-blot及Real-time PCR方法檢

2、測(cè)多囊腎病動(dòng)物模型pkd1-/-小鼠及正常對(duì)照pkd1+/+小鼠腎臟中、人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞(WT9-12)及正常腎小管上皮細(xì)胞(RCTEC)中熱休克蛋白75(Heat shock protein75，HSP75)、線粒體內(nèi)膜移位酶44(Translocases of the inner membrane44，Tim44)、線粒體外膜移位酶20(Translocases of the outer membrane20，Tim20)、

3、細(xì)胞色素C的表達(dá)差異。
　　(2)采用透射電鏡觀察WT9-12及RCTEC中線粒體的結(jié)構(gòu)形態(tài)差異。
　　2.多囊腎病中初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)及功能異常的生物學(xué)驗(yàn)證
　　(1)采用Western-blot方法檢測(cè)pkd1-/-小鼠及pkd1+/+小鼠腎臟中、WT9-12及RCTEC中驅(qū)動(dòng)蛋白2(Kinesin2)、IFT88的蛋白水平表達(dá)差異。
　　(2)采用Real-time PCR方法檢測(cè)WT9-12及RCTEC中Kin

4、esin2的表達(dá)差異。
　　(3)采用透射電鏡、免疫熒光方法觀察WT9-12及RCTEC中初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)差異。
　　3.HSP75對(duì)線粒體功能及初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究
　　(1)采用Western-blot方法檢測(cè)WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后TIM44、TOM20、細(xì)胞色素C、Kinesin2、IFT88的表達(dá)差異。
　　(2)采用Western-blot方法檢測(cè)RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HS

5、P75表達(dá)后TIM44、TOM20、細(xì)胞色素C、Kinesin2、IFT88的表達(dá)差異。
　　(3)采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化。
　　(4)采用MTT法觀察WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后細(xì)胞增殖的變化。
　　(5)采用激光共聚焦方法觀察WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表

6、達(dá)HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)的變化。
　　(6)采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)WT9-12中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后、RCTEC中siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。
　　結(jié)果:
　　1.Westem-blot及Real-time PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pkd1-/-小鼠腎臟中HSP75、TIM44、TOM20表達(dá)較pkd1+/+小鼠減少，細(xì)胞色素C表達(dá)增多，WT

7、9-12中得到相同結(jié)果。
　　2.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)與RCTEC比較，WT9-12中線粒體形態(tài)明顯腫脹，線粒體嵴消失。
　　3.免疫熒光發(fā)現(xiàn)與RCTEC比較，WT9-12中初級(jí)纖毛數(shù)量變少，長(zhǎng)度變短甚至消失。
　　4.WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后TIM44、TOM20表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞色素C表達(dá)下調(diào)，Kinesin2、IFT88表達(dá)上調(diào)。
　　5.RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后TIM44、TO

8、M20表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞色素C表達(dá)上調(diào)，Kinesin2、IFT88表達(dá)下調(diào)。
　　6.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP發(fā)現(xiàn)WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后細(xì)胞內(nèi)ATP量明顯減少。RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)ATP量明顯增加。
　　7.MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后促進(jìn)細(xì)胞增殖，RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后抑制細(xì)胞增殖。
　　8.激光共聚焦發(fā)現(xiàn)WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

9、過(guò)表達(dá)HSP75后初級(jí)纖毛長(zhǎng)度變長(zhǎng)，RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后初級(jí)纖毛長(zhǎng)度明顯變短。
　　9.WT9-12轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)HSP75后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無(wú)明顯差異，RCTEC siRNA干擾下調(diào)HSP75表達(dá)后72小時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯減低。
　　結(jié)論:
　　本研究結(jié)果表明，多囊腎病模型鼠腎臟及人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞中存在線粒體損傷，且初級(jí)纖毛的結(jié)構(gòu)和纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能存在異常，線粒體損傷可能通過(guò)能量代