羅格列酮聯(lián)合雷帕霉素抑制多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖及機(jī)制研究.pdf

1、常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)是人類最常見的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率在1/400-1/1000，我國約有150萬患者，占終末期腎衰竭病因5％-10％。ADPKD主要特征表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟出現(xiàn)許多個進(jìn)行性增大的液性囊泡，最終破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和功能。50％患者在60歲時會進(jìn)展至終末期腎衰竭。ADPKD除累及腎臟外，還引起肝、胰囊腫、心瓣膜病、結(jié)腸憩室和顱內(nèi)動脈瘤等腎外病變，是一種嚴(yán)重危害人類健康的系統(tǒng)性疾病。
　　 多年來，腎臟病學(xué)者

2、一直致力于尋找治療多囊腎病的有效方法，基因治療目前存在許多障礙有待克服，通過藥物治療延緩腎衰竭進(jìn)展是目前的主要研究方向。多囊腎病治療需要早期、長期用藥，因此藥物的安全性成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。由于ADPKD的分子發(fā)病及調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，很多問題尚未闡明，因此針對不同發(fā)病環(huán)節(jié)研發(fā)不同藥物，聯(lián)合用于治療不僅可增強(qiáng)療效，而且減少不良反應(yīng)，將具有潛在的的應(yīng)用前景。
　　 噻唑烷二酮類PPARγ激動劑，如吡格列酮和羅格列酮等，主要用于糖尿病

3、治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，噻唑烷二酮類PPARγ激動劑可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。2001年Muto等首先觀察到吡格列酮可延長多囊蛋白1基因敲除小鼠(pkd1-/-)的生存期(通常在胎兒期死亡)；我科先前動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可抑制Han：SPRD大鼠囊腫的進(jìn)展，延長大鼠生存期，但其機(jī)制尚未完全闡明。
　　 mTOR信號通路異常激活被認(rèn)為是多囊腎病發(fā)生的重要機(jī)制，新生血管的形成也可促進(jìn)多囊腎病的進(jìn)展；因此我們探討羅格列酮對mTOR信號

4、通路的作用，研究其對新生血管形成中起重要作用的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的作用；同時觀察羅格列酮與mTOR抑制劑雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用對延緩ADPKD進(jìn)展的作用，為治療多囊腎病尋找新的途徑。
　　 為此，我們首先研究了羅格列酮對多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的作用。多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞系(WT9-12)由美國哈佛大學(xué)周晶教授饋贈。培養(yǎng)的WT9-12細(xì)胞給予不同濃度的羅格列酮培養(yǎng)24、48、72 h，采用MT法檢測結(jié)

5、果顯示：羅格列酮明顯抑制WT9-12細(xì)胞的增殖，呈時間、劑量依賴性。預(yù)72h時，50％抑制率濃度為100μM。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡，結(jié)果顯示羅格列酮明顯抑制WT9-12細(xì)胞周期，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，G0/G1期細(xì)胞增加30％，與對照組比較有差異有顯著性意義(P＜0.05)，其對細(xì)胞凋亡的影響不大，羅格列酮濃度高達(dá)200μM時，僅使細(xì)胞凋亡增加6％。多囊腎病的發(fā)展過程伴有胰島素生長因子1(IGF-1)表達(dá)的增加，我們的

6、研究發(fā)現(xiàn)囊腫襯里上皮細(xì)胞對IGF-1的刺激反應(yīng)較其它永生化腎小管上皮細(xì)胞(RCTEC)更為明顯。IGF-150ng/ml可誘導(dǎo)囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖增加20％，而對RCTEC無明顯影響。羅格列酮可完全抑制IGF-1誘導(dǎo)的WT9-12細(xì)胞增殖，該作用在羅格列酮12.5μM時即表現(xiàn)明顯的抑制作用。說明羅格列酮在有IGF-1作用下對囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯。
　　 mTOR信號通路異常激活在多囊腎病發(fā)病及發(fā)展中起重要作用，

7、為多種發(fā)病機(jī)制的共同環(huán)節(jié)，抑制mTOR信號通路可明顯抑制多囊腎病的進(jìn)展，p70S6K及4E-Bp1是mTOR兩個主要下游底物。用不同濃度的羅格列酮作用WT9-12細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用Western blot方法檢測p-mTOR/mTOR及其下游p-p70S6K/p70S6K、p-4E-Bp1/4E-Bp1。結(jié)果顯示羅格列酮下調(diào)p70S6K磷酸化水平，呈時間及劑量依賴性，而對mTOR及其另一個下游底物4E-Bp1的磷酸

8、化水平無明顯影響。mTOR特異性抑制劑雷帕霉素聯(lián)合羅格列酮抑制p70S6K的磷酸化作用強(qiáng)于單用羅格列酮，不僅表明羅格列酮是不經(jīng)由mTOR抑制p70S6K的磷酸化，且雷帕霉素聯(lián)合羅格列酮可對mTOR信號通路下游p70S6K的磷酸化抑制有疊加作用，也為mTOR抑制劑雷帕霉素聯(lián)合羅格列酮治療ADPKD提供理論基礎(chǔ)。
　　 羅格列酮的作用有PPARγ依賴和非依賴兩種途徑。為研究羅格列酮對多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞mTOR/p70S6K信號通

9、路的影響是否通過PPARγ依賴途徑，在給予PPARγ異性抑制劑GW9662預(yù)孵后再給予羅格列酮發(fā)現(xiàn)：GW9662僅部分抵消了羅格列酮對細(xì)胞增殖的抑制作用。同樣，在給予GW9662抑制劑后再給予羅格列酮可抑制羅格列酮對p-p70S6K的下調(diào)效應(yīng)，進(jìn)一步采用siRNA干擾技術(shù)，將PPARγ siRNA瞬時轉(zhuǎn)染W(wǎng)T9-12細(xì)胞后，采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，羅格列酮仍部分抑制p70S6K的磷酸化，這些結(jié)果表明羅格列酮對細(xì)胞增殖抑制以

10、及對mTOR/p70S6K信號通路的抑制作用可能部分通過PPARγ依賴性和非依賴性兩條途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 新生血管的形成是腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，也是多囊腎病進(jìn)展的主要因素。VEGF在新生血管形成中起著重要作用。低(缺)氧可誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF1-α)高表達(dá)，繼而促進(jìn)VEGF表達(dá)。我們對多囊腎病模型Han:SPRD大鼠的觀察發(fā)現(xiàn)，在4周齡大鼠腎臟，VEGF表達(dá)已增加，此時局部缺氧不明顯，HIF1-α的表達(dá)明顯上調(diào)。但

11、是，TNF-α表達(dá)在早期大鼠腎臟出現(xiàn)增加，表明VEGF的表達(dá)上調(diào)早于HIF1-α，且與局部的炎癥同步。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，TNF-α不僅能誘導(dǎo)多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF，其他炎癥因子如LPS也同樣可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)；說明誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)并不是TNF-α所特有，是炎癥的共有特征。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還證實(shí)TNF-α并不能誘導(dǎo)HIF1-α的表達(dá)，也提示TNF-α對VEGF的作用并不通過HIF1-α。因此，早期抑制炎癥反應(yīng)也可減緩多囊腎病的進(jìn)

12、展。羅格列酮可下調(diào)囊腫襯里上皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)，呈劑量依賴性，而且羅格列酮對TNFα誘導(dǎo)的VEGF高表達(dá)抑制更明顯，可使其下降到應(yīng)用TNFα前的水平。羅格列酮長期用于糖尿病的治療，副作用小，因此適用于多囊腎病的早期治療及長期治療。
　　 基于以上結(jié)果，我們聯(lián)合應(yīng)用羅格列酮和雷帕霉素抑制多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖及VEGF的表達(dá)，從而為多囊腎病的治療提供新的方法。我們給予WT9-12細(xì)胞不同濃度的羅格列酮、雷帕霉素、羅格列酮

13、+雷帕霉素，作用72 h，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù)(R值)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡，采用realtime-PCR技術(shù)檢測VEGFmRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示：羅格列酮和雷帕霉素均能抑制囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，并且二者聯(lián)合應(yīng)用有疊加作用，羅格列酮單獨(dú)應(yīng)用對細(xì)胞凋亡的作用不明顯，但與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用可明顯促進(jìn)凋亡，具有協(xié)同效應(yīng)。二者具有協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制可能與羅格列酮抑制mTOR下游p70S6K的磷酸化，

14、雷帕霉素抑制mTOR活性，雙重阻滯促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。我們采取序貫用藥的方式研究發(fā)現(xiàn)：先用雷帕霉素再序貫應(yīng)用羅格列酮可增強(qiáng)抑制細(xì)胞增殖的作用，具有明顯的協(xié)同效應(yīng)(R＞1)。雷帕霉素和羅格列酮可分別抑制多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)(VEGF表達(dá)下調(diào)30％和18％)，但兩藥聯(lián)合作用細(xì)胞時，二者的作用可明顯加強(qiáng)(VEGF下降54％)。一方面可能與羅格列酮及雷帕霉素對mTOR信號通路的共同作用有關(guān)，另一方面，羅格列酮可抑制炎癥，抑制TNFα

15、的表達(dá)，而我們的研究發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)與TNFα有關(guān)，因此羅格列酮也可能通過下調(diào)TNFα抑制了VEGF的表達(dá)，從而通過多途徑，不同的信號通路共同作用，抑制多囊腎病的進(jìn)展。
　　 總之，本研究表明噻唑烷二酮類PPARγ激動劑羅格列酮可通過直接抑制mTOR的下游p70S6K的磷酸化而抑制囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此作用為PPARγ依賴性的。多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞較RCTEC對IGF-1刺激更為敏感，而羅

16、格列酮可完全阻斷IGF-1所誘導(dǎo)的囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖。羅格列酮可下調(diào)囊腫襯里上皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)，從而抑制多囊腎病的血管形成，此作用在有TNFα刺激下更明顯，可完全抑制TNFα誘導(dǎo)的VEGF上調(diào)。羅格列酮與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用可明顯抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及VEGF表達(dá)，二者聯(lián)合應(yīng)用較單藥有明顯的疊加效應(yīng)，而序貫用藥方式，即先用羅格列酮再序貫應(yīng)用雷帕霉素，對細(xì)胞的增殖有明顯的協(xié)同效應(yīng)。
　　 目前多囊腎病的治療仍是