羅格列酮聯(lián)合雷帕霉素治療常染色體顯性多囊腎病作用及機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一種最常見的遺傳性腎病，其病理特征是雙側(cè)腎臟出現(xiàn)眾多進行性增大的液性囊泡，最終腎臟的結(jié)構(gòu)和功能被嚴重破壞，導(dǎo)致腎臟功能衰竭。國外資料表明ADPKD的發(fā)病率為1/500～1/1000，至60歲時，有50％以上的患者進入終末期腎衰竭，占所有引起終末期腎衰竭病因的5％～10％。據(jù)統(tǒng)計，我

2、國目前大約有150萬患者。上海透析登記資料表明，ADPKD是造成終末期腎衰竭的第四位病因，約為5.4％。ADPKD除引起腎衰竭外，還累及多個腎外器官，如多囊肝、結(jié)腸憩室、顱內(nèi)動脈瘤、心臟瓣膜異常、胰管及膽管擴張等疾病。因此，ADPKD也是一種系統(tǒng)性疾病。目前已知，引起ADPKD的主要致病基因有pkd1和pkd2兩個，其表達產(chǎn)物分別為多囊蛋白-1(polycistin1，PC-1)和多囊蛋白-2(polycistin，2，PC-2)。多囊

3、蛋白-1和多囊蛋白-2結(jié)構(gòu)和功能異常引起腎囊腫襯里上皮細胞類腫瘤樣的持續(xù)增殖;細胞極性改變;分泌入囊腔的液體量大于重吸收量，液體在腎囊腫內(nèi)積聚;以及腎間質(zhì)炎癥、纖維化及血管異常增生等。由此，腎臟囊腫不斷生成，原有囊腫體積不斷增大，壓迫正常腎組織，破壞其原有結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致終末期腎病。其中囊腫襯里上皮細胞過度增殖是其主要發(fā)病機制之一，ADPKD也因此被稱為類腫瘤疾病。
　　 ADPKD的致病機制復(fù)雜，主要的致病機制有mTOR信

4、號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活;抗利尿激素V2受體-cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào);纖毛機械-鈣離子內(nèi)流障礙等。作為一種類腫瘤性疾病，ADPKD與調(diào)控器官大小的信號通路改變密切相關(guān)。mTOR信號通路是與細胞異常增殖、腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的通路之一。近些年來研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路的異常在ADPKD發(fā)病過程中起到了重要作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin，mTOR)是高度保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸激酶，為磷酸肌醇

5、激酶相關(guān)激酶(phosphoinositide kinase-related kinase，PIKK)家族成員之一。根據(jù)核心組成部分不同，可分為mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體。mTORC1及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用主要為調(diào)節(jié)細胞生長及代謝。mTORC2及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子主要調(diào)節(jié)細胞骨架中的肌動蛋白合成及細胞凋亡。mTOR通路的調(diào)節(jié)機制復(fù)雜，mTORC1與mTORC2、mTORC1與其負反饋通路之間均存在著相互調(diào)節(jié)關(guān)系。激活mTO

6、RC1通路可以通過其下游核糖體S6激酶(S6K)抑制mTORC2-Akt通路，也能通過PI3K-Akt通路反饋激活TSC1/2復(fù)合體，對mTORC1通路起反饋調(diào)節(jié)作用。正常情況下，多囊蛋白1對mTORC1及mTORC2通路均起抑制作用。當多囊蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能異常時，mTORC1通路及mTORC2通路激活，引起腎囊腫襯里上皮細胞異常增殖和去分化，導(dǎo)致囊腫生成及增長。雷帕霉素能夠特異性抑制mTORC1，多項動物實驗研究發(fā)現(xiàn)使用雷帕霉素特異

7、性抑制mTORC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能抑制多囊腎病模型腎囊腫的形成和增大。但是近年來的前瞻性多中心臨床研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用雷帕霉素及其衍生物并不能延緩ADPKD患者腎功能的損害，也不能改善其預(yù)后。
　　 PPARγ屬于配體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子超家族，可以在包括腎臟及肝臟的多種組織內(nèi)表達。PPARγ激動劑除了可以對代謝的調(diào)節(jié)，用于糖尿病的治療外，還能通過抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制炎癥因子的產(chǎn)生、細胞外基質(zhì)的形成及抑制新生血管的形成，從

8、而具有抗腫瘤、抗纖維化、抗炎癥的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑還能通過β-catenin，c-Myc，CFTR，MCP-1，ERK及TGF-β等信號通路的作用抑制多囊腎的進展。因此，本研究旨在觀察mTOR通路分子在ADPKD腎組織中的表達變化，觀察聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素及羅格列酮對多囊腎大鼠模型的治療作用及其對mTOR通路信號分子的影響，并探討聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素及羅格列酮對腎囊腫襯里上皮細胞過度增殖的影響及其機制，為臨床尋找治療多囊腎病

9、的有效藥物奠定實驗及理論基礎(chǔ)。
　　 實驗方法：
　　 1.留取不同周齡的雄性雜和型Han:SPRD雜合型大鼠及野生型Han:SPRD大鼠的血液標本、腎組織，進行生化分析及組織學(xué)分析，觀察不同周齡Han:SPRD雜合型大鼠腎功能的變化以及腎臟的形態(tài)學(xué)改變;
　　 2.采用Western blotting方法檢測不同周齡Han:SPRD大鼠雜合型大鼠腎組織中mTOR、p70S6K及其相應(yīng)磷酸化蛋白表達的變化以及與野

10、生型大鼠的表達差異;
　　 3.采用Western blotting方法檢測了ADPKD患者及正常人腎組織中mTOR、p70S6K及其相應(yīng)磷酸化蛋白的表達的差異;
　　 4.單獨及聯(lián)合使用不同劑量雷帕霉素及羅格列酮作用于雄性Han:SPRD雜合型大鼠24周，留取血液標本、腎組織，進行生化分析及組織學(xué)分析，以觀察聯(lián)合用藥對大鼠腎功能的保護作用以及大鼠組織學(xué)改變;
　　 5.免疫組化檢測核增殖抗原PCNA以及mTOR

11、通路下游分子p70S6K的表達，以觀察聯(lián)合用藥對細胞增殖的影響以及對mTOR通路的調(diào)控;
　　 6.使用Western blotting檢測雄性雜合型Han:SPRD大鼠腎組織中mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達水平變化，以觀察羅格列酮及雷帕霉素對多囊腎大鼠模型mTOR信號通路的影響;
　　 7.采用MTT法檢測單獨及聯(lián)合使用羅格列酮及雷帕霉素干預(yù)WT9-12細胞培養(yǎng)后對細胞增殖的影響;
　　 8.采用流式細胞術(shù)檢測

12、單獨及聯(lián)合使用羅格列酮及雷帕霉素干預(yù)于WT9-12細胞培養(yǎng)后對細胞凋亡及細胞周期的影響;
　　 9.采用Western blotting方法檢測WT9-12細胞中mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達水平變化，以觀察使用羅格列酮及雷帕霉素干預(yù)后對WT9-12細胞中mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達的影響。
　　 10.在分別單獨及聯(lián)合使用雷帕霉素、羅格列酮干預(yù)WT9-12細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加用PI3K特異性抑制劑LY294002，以觀

13、察在阻斷mTORC1負反饋途徑的情況下，羅格列酮對磷酸化Akt、ERK表達的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.留取不同周齡的雄性雜合型Han:SPRD大鼠血液標本、腎組織，經(jīng)生化分析及組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在4周齡時，雄性雜合型大鼠腎功能與野生型大鼠的腎功能改變無顯著差異，此后雄性雜合型大鼠的腎功能迅速衰退，12周時雜合型大鼠的血尿素氮與野生型大鼠產(chǎn)生顯著性差異（13.19±1.38 vs7.28±1.60），20周后腎功能減退速

14、度趨緩;其囊腫指數(shù)增加及腎重/體重比的下降變化規(guī)律與腎功能的變化類似。
　　 2.采用Western blotting方法檢測不同周齡大鼠腎組織發(fā)現(xiàn)在雜合型Han:SPRD大鼠腎組織中磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K蛋白表達量較野生型Han:SPRD大鼠腎組織明顯升高，不同周齡的大鼠均處于激活狀態(tài)，但激活程度與大鼠周齡無關(guān)。
　　 3.采用Western blotting方法檢測了ADPKD患者及正常人腎組織發(fā)現(xiàn)在AD

15、PKD患者腎組織中磷酸化mTOR、p70S6K的表達水平均較正常對照腎組織明顯增高。
　　 4.體內(nèi)實驗證實雷帕霉素與羅格列酮聯(lián)合應(yīng)用，與雷帕霉素單獨應(yīng)用相比，可以更顯著的抑制囊腫的發(fā)生、發(fā)展，降低大鼠的腎重/體重比;且能顯著改善大鼠腎功能。同時發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥可以較小用藥劑量獲得更好的治療效果，小劑量雷帕霉素(0.5mg/kg)與羅格列酮合用后即可獲得類似單用雷帕霉素(2 mg/kg)的治療效果（血尿素氮，21.96 vs21.5

16、9，P＞0.05）。此外，羅格列酮還能夠改善由雷帕霉素引起的高脂血癥，顯示出聯(lián)合用藥不但效果較單獨用藥好，還有很好的安全性及更少的副作用。聯(lián)合用藥后可以更明顯的改善囊腫指數(shù)，亦可改善腎間質(zhì)炎細胞浸潤及間質(zhì)纖維化。
　　 5.腎組織核增殖抗原PCNA免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥均可以明顯抑制細胞增殖，相較于單獨用藥組也有更好的效果。70S6K為mTOR信號通路的下游分子，免疫組化檢測結(jié)果顯示，雷帕霉素及羅格列酮均可降低p70S6K

17、著色的陽性細胞數(shù)，聯(lián)合用藥的后小劑量組能進一步降低p70S6K著色的陽性細胞數(shù)，其中小劑量雷帕霉素(0.5mg/kg)與羅格列酮聯(lián)用組效果尤其明顯，與單獨使用羅格列酮(4.65±2.74 vs11.17±3.60)或小劑量雷帕霉素(4.65±2.74 vs10.60±3.65)均有顯著性差異。
　　 6.Western blotting分析結(jié)果顯示聯(lián)合使用羅格列酮后，Akt及ERK的磷酸化水平均顯著降低，提示羅格列酮可能拮抗由雷

18、帕霉素引起的mTORC1負反饋通路及mTORC2通路激活。羅格列酮可明顯增強雷帕霉素的療效可能與此有關(guān)。
　　 7.MTT法檢測發(fā)現(xiàn)使用羅格列酮及雷帕霉素均能降低囊腫襯里上細胞增殖率，其中羅格列酮100μ M干預(yù)細胞72小時可以使細胞增殖率降低至54.53±4.22％，雷帕霉素100ng/ml干預(yù)細胞72小時可以使細胞增殖率降低至55.22±2.13％，兩者聯(lián)合使用可以進一步抑制囊腫襯里上細胞增殖率至45.96±1.21％，組間

19、比較均有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 8.流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)單用雷帕霉素可以促進細胞凋亡，單獨使用羅格列酮相對于對照組并不能促進細胞凋亡，但與雷帕霉素聯(lián)用后卻可以顯著加強雷帕霉素誘導(dǎo)細胞凋亡的效果;同時發(fā)現(xiàn)羅格列酮及雷帕霉素分別單獨使用均能夠抑制細胞周期，使更多細胞處于G0/G1期，兩者聯(lián)合使用可以使其對細胞周期抑制的作用更加明顯。
　　 9.采用Western blotting方法分析羅格列酮及雷帕霉素干預(yù)后，WT9-12細胞中

20、mTOR信號通路相關(guān)蛋白磷酸化Akt、ERK的表達，可以發(fā)現(xiàn)單獨使用羅格列酮即可降低其表達，與雷帕霉素聯(lián)合使用后可以顯著減弱由雷帕霉素引起的磷酸化Akt、ERK蛋白的上調(diào)，提示羅格列酮可能通過對PI3K的抑制發(fā)揮作用。
　　 10.在分別單獨雷帕霉素、羅格列酮及其聯(lián)合使用作用于WT9-12細胞的基礎(chǔ)上，加用PI3K特異性抑制劑LY294002，觀察在阻斷mTORC1負反饋途徑的基礎(chǔ)上，羅格列酮對磷酸化Akt、ERK表達的影響。發(fā)

21、現(xiàn)在此基礎(chǔ)上使用羅格列酮可以進一步降低磷酸化Akt蛋白的表達水平，卻無法使磷酸化ERK的表達水平進一步下降。這樣的結(jié)果顯示羅格列酮還可以通過mTORC1負反饋環(huán)路之外的途徑對Akt的起到抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 在ADPKD發(fā)生和發(fā)展過程中腎組織內(nèi)mTOR信號通路異常激活，并通過其下游分子S6K活性的增強導(dǎo)致細胞異常增殖和細胞凋亡的抑制。體內(nèi)實驗證實使用羅格列酮聯(lián)合雷帕霉素治療Han: SPRD大鼠可以獲得比單獨使