Hippo通路在常染色體顯性多囊腎病發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一種常見的遺傳性腎臟疾病，以雙。腎出現(xiàn)多發(fā)性進展性的液性囊泡為特點，除引起腎衰竭外，還累及多種腎外器官，如肝囊腫、胰膽管擴張、結(jié)腸憩室、腦動脈瘤、心臟瓣膜畸形等表現(xiàn)，是一種系統(tǒng)性疾病，嚴重危害人類健康。進入終末期。腎衰竭的患者需要依靠透析或腎移植維持生命，給社會和家庭帶來巨大負擔。目

2、前已知ADPKD致病基因主要為pkd1和pkd2，但該病的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前主要有“二次打擊”和“纖毛致病”兩種理論學說。囊腫襯里上皮細胞過度增殖是其發(fā)病機制之一，因此，ADPKD也被稱為類腫瘤疾病?，F(xiàn)有研究已證明，ADPKD腎臟囊腫發(fā)生及進展的病理生理過程主要是：腎囊腫襯里上皮細胞類腫瘤樣持續(xù)增殖與凋亡異常；細胞極性改變和分化不良及囊腔液體在囊腫內(nèi)大量聚集積聚，擠壓周圍腎實質(zhì)。上述過程使得正常腎組織不斷產(chǎn)生新的囊腫，現(xiàn)有囊腫也

3、逐漸增大，壓迫正常腎組織，最終發(fā)展為終末期腎病。
　　 作為一種類腫瘤性疾病，ADPKD與調(diào)控器官大小的信號通路改變密切相關(guān)。mTOR信號通路是與細胞異常增殖、腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的通路之一。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)了除mTOR通路之外的另一條專一參與器官大小調(diào)控的信號通路，即Hippo通路，后者主要通過綜合調(diào)控細胞增殖和凋亡發(fā)揮控制器官大小的作用。正是由于Hippo通路的重要功能，使得其在人類腫瘤及其他疾病的發(fā)病機制中扮演了重要的角色。

4、
　　 Hippo蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，Hippo信號通路于2007年采用遺傳鑲嵌掃描技術(shù)在果蠅中發(fā)現(xiàn)Hippo激酶后命名。Hippo通路在哺乳動物中高度保守，目前有很多研究證明，該通路主要信號分子對器官生長的大小具有重要的調(diào)控作用?，F(xiàn)有證據(jù)表明，Hippo通路對腫瘤發(fā)生具有重要影響。人腎癌細胞系A(chǔ)CHN和人黑色素瘤組織中分別觀察到SAV1和Mob1基因的突變，結(jié)腸癌組織中Mob1表達較正常結(jié)腸組織明顯下調(diào)。Lats1/

5、2的下調(diào)現(xiàn)象存在于多種腫瘤(如人類卵巢癌、侵襲性乳腺癌、星形細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤和急性淋巴細胞白血病等)中；人類軟組織肉瘤和結(jié)腸癌中也觀察到Mst1/2表達的降低；在肝臟中同時條件性敲除Mst1和Mst2基因也可引起巨大肝細胞癌，但在這種小鼠中再次敲除YAP基因則可逆轉(zhuǎn)肝癌細胞表型。作為Hippo通路下游的主要效應(yīng)分子，在人類多種腫瘤(如肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌)中也觀察到Y(jié)AP的表達和核轉(zhuǎn)位的增加。
　　 作為近

6、年來新發(fā)現(xiàn)的一條信號通路，到目前為止，Hippo通路在ADPKD中的研究僅限于該通路靶蛋白YAP在ADPKD動物模型Pkd-1基因敲除小鼠囊腫襯里上皮細胞與擴張的腎小管上皮細胞中的表達變化，但Hippo通路中其他分子的改變及其在人類腎臟與其它動物模型中的變化，尚未見報道。此外，Hippo通路是否與細胞增殖相關(guān)的其它信號通路存在聯(lián)系，共同引起上皮細胞生長發(fā)育和凋亡異常也尚無研究。因此，本研究旨在觀察Hippo通路分子及靶分子YAP與TAZ

7、在ADPKD腎組織中的表達變化，探討Hippo通路分子對于腎囊腫襯里上皮細胞過度增殖的影響及其機制，為臨床尋找治療多囊腎病的有效藥物奠定實驗及理論基礎(chǔ)。
　　 實驗方法
　　 1.采用免疫熒光化學染色及激光共聚焦方法，觀察Han：SPRD大鼠雜合型及野生型腎組織中LATS1、YAP及TAZ的表達及分布變化；
　　 2.采用Western blotting方法檢測Han：SPRD大鼠雜合型及野生型腎組織中LATS1

8、、磷酸化LATS1、YAP、磷酸化YAP及TAZ蛋白水平表達差異；
　　 3.采用Real-time PCR方法檢測ADPKD患者與正常對照腎組織中MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ mRNA的表達變化；
　　 4.采用MTT法觀察用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中YAP和TAZ表達后對細胞生長增殖能力的影響。
　　 5.采用流式細胞術(shù)與Western blotting法檢測用RNAi特異性抑制WT

9、9-12細胞中YAP與TAZ表達后細胞凋亡的變化；
　　 6.采用流式細胞術(shù)檢測用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中YAP與TAZ表達后細胞周期的變化；并用Real-time PCR與Western blotting法在mRNA和蛋白質(zhì)水平驗證細胞周期改變相關(guān)蛋白的表達；
　　 7.采用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中LATS1表達后，用Western blotting法檢測YAP蛋白及YAP磷酸化水平變化，以驗證

10、WT9-12細胞中，LATS1是否為YAP磷酸化的主要蛋白；
　　 8.采用MTT法發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中LATS1表達后對細胞增殖的影響；
　　 9.采用流式細胞術(shù)與Western blotting法檢測用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中LATS1表達后細胞凋亡的變化；
　　 10.采用流式細胞術(shù)檢測用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中LATS1表達后細胞周期的變化；并用Western

11、 blotting法驗證細胞周期相關(guān)蛋白表達變化。
　　 結(jié)果
　　 1.采用免疫熒光化學染色及激光共聚焦方法發(fā)現(xiàn)Han：SPRD大鼠雜合型腎囊腫襯里上皮細胞LATS1表達較野生型明顯減弱，但YAP卻呈強陽性表達，且在胞漿與胞核中均有分布，而野生型僅在于胞漿中微弱表達，胞核內(nèi)無YAP分布；TAZ的表達與分布在雜合型和野生型大鼠無明顯差異；
　　 2.采用Western blotting方法發(fā)現(xiàn)在Han：SPRD大

12、鼠雜合型腎組織中LATS1和磷酸化LATS1蛋白表達量較野生型明顯降低；YAP蛋白表達量則較野生型多，而磷酸化YAP蛋白表達水平顯著減少；TAZ蛋白表達二者無明顯差異；
　　 3.采用Real-time PCR方法發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)ADPKD患者腎組織中MST1/2、LATS1和TAZ的mRNA表達均較正常對照腎組織降低，YAP的mRNA表達二者無明顯差異；
　　 4.采用MTT法發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中YAP表

13、達可抑制細胞的生長增殖能力，48、72和96小時細胞增殖的抑制率分別為22.66％、31.41％和33.37％；而下調(diào)TAZ對WT9-12細胞僅有輕微的抑制作用；
　　 5.采用流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中YAP與TAZ表達后不增加WT9-12細胞的凋亡率，Western blotting法也表明促凋亡蛋白caspse-3的底物PARP蛋白無明顯變化，說明下調(diào)YAP與TAZ不能誘導(dǎo)細胞凋亡；
　　

14、 6.采用流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中YAP表達48小時時能使細胞周期阻滯在G0/G1期，Real-time PCR與Western blotting還發(fā)現(xiàn)G0/G1期特異性周期調(diào)控蛋白CyclinD1與CyclinE的表達在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有下調(diào)，而周期負性調(diào)節(jié)蛋白P21表達則明顯上調(diào)；但TAZ表達變化不顯著；
　　 7.采用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中LATS1表達后，用Western

15、blotting法發(fā)現(xiàn)細胞中YAP蛋白表達無明顯影響，但YAP磷酸化水平有顯著抑制作用，表明在WT9-12細胞中，LATS1是磷酸化YAP的主要蛋白，LATS1表達下調(diào)可增加YAP的活化水平；
　　 8.采用MTT法發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中LATS1表達可促進細胞增殖，24、48、72和96小時WT9-12細胞增殖率分別為113.22％、116.27％、111.80％和106.81％：
　　 9.采用流

16、式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性抑制WT9-12細胞中LATS1表達后對WT9-12細胞凋亡無明顯影響，Western blotting法也表明誘導(dǎo)細胞信號通路信號分子caspse-3的底物PARP蛋白裂解無明顯改變，說明下調(diào)LATS1不能抑制細胞凋亡；
　　 10.采用流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)用RNAi特異性下調(diào)WT9-12細胞中LATS1表達48小時能促進細胞周期，使更多細胞處于S期；Western blotting分析發(fā)現(xiàn)S期特異性周期

17、調(diào)控蛋白CyclinA的表達明顯上調(diào)，G0/G1期特異性周期調(diào)控蛋白CyclinD1與CyclinE表達也有所上調(diào)，而負性調(diào)控蛋白P21的表達卻明顯下調(diào)，表明LATS1能抑制促進WT9-12細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達，促進細胞周期，導(dǎo)致囊腫襯里上皮細胞增殖。
　　 結(jié)論
　　 通過ADPKD患者和實驗動物腎組織樣本的組織學觀察、基因表達的mRNA和蛋白質(zhì)水平都證明腎小管上皮細胞內(nèi)Hippo信號通路被抑制，YAP去磷酸化活