常染色體顯性多囊腎病發(fā)病機制的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、常染色體顯性多囊腎病(autosomaldominantpolycystickidneydisease,ADPKD)是人類最常見的單基因遺傳性腎臟疾病之一，發(fā)病率約1/400～1/1000，主要表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟形成多個液性囊腫、進行性增大，破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭。除累及腎臟外，該病還引起肝囊腫、顱內(nèi)動脈瘤、心臟瓣膜異常等系統(tǒng)損害。目前缺乏高靈敏度、高特異性、簡便易行的早期診斷方法，并無有效的治療手段。近年來，隨該病研究

2、的深入，其發(fā)病機制的闡述正不斷更新，但其發(fā)病機制仍未完全闡明。而今比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析為尋找與疾病發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)提供了新途徑，使研究者得以由全面探索發(fā)病中發(fā)生變化的蛋白質(zhì)入手，從一個嶄新的視角認識疾病的發(fā)病機制。該研究采用同位素編碼的親和標簽技術(shù)(isotope-codedaffinitytag，ICAT)與二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(twodimensionalliquidchromatography-tandemmassspectrom

3、etry，2DLC-MS/MS)相結(jié)合的定量比較蛋白組學(xué)方法對ADPKD的發(fā)病機制進行探討，旨在盡可能多地尋找與該病發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)，為進一步闡明ADPKD的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)，為該病的早期診斷標志物及治療靶標的開發(fā)研究提供新思路。 該文首先制備了ADPKD患者(多囊腎病基因1突變)與正常成人尿液、血清蛋白組樣品，以及囊腫襯里上皮細胞與正常腎小管上皮細胞的蛋白質(zhì)組樣品，分別對兩尿液、兩血清及兩細胞蛋白質(zhì)組樣品進行比較。在兩參比

4、蛋白質(zhì)組中，用CleavableICAT重試劑(含9個13C)標記ADPKD患者蛋白質(zhì)組樣品，用CleavableICAT輕試劑(含9個12C，較重試劑輕9Da)，標記位點為肽鏈上的cysteine殘基。標記后的兩參比蛋白質(zhì)組樣品混和并以胰蛋白酶水解，經(jīng)陽離子交換去除未反應(yīng)試劑等雜質(zhì)后，以avidin親和層析柱將溶液中含cysteine的被標記肽段(含親和力標簽biotin)篩選出來。篩選出的被標記肽段混合物裂解去除親和力標簽并以2DL

5、C-MS/MS進行分離和質(zhì)量檢測，并通過ProICAT軟件分析，鑒定被標記肽段，從而鑒定蛋白質(zhì)。同時，軟件計算某蛋白質(zhì)各重試劑標記肽段的肽指紋總面積與各輕試劑標記肽段的肽指紋總面積比(H：L)作為該蛋白質(zhì)在ADPKD樣品與正常對照樣品中的豐度比。從被鑒定的差異蛋白質(zhì)中，選擇肽段可信度最高的血清白蛋白(serumalbumin，SALB)，并在差異蛋白質(zhì)中隨機選擇5種尿蛋白質(zhì)、4種血清蛋白質(zhì)以及4種細胞蛋白質(zhì)，分別用免疫印跡法或免疫熒光結(jié)

6、合激光共聚焦掃描的方法驗證其在兩對應(yīng)參比蛋白組樣品中的豐度差異。 經(jīng)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，兩尿蛋白質(zhì)組共鑒定出106種蛋白質(zhì)，ADPKD患者中水平較正常上調(diào)者48種，下調(diào)者45種；兩血清蛋白質(zhì)組樣品中共鑒定出159種蛋白質(zhì)，ADPKD患者中水平較正常上調(diào)者24種，下調(diào)者24種；兩細胞蛋白質(zhì)組樣品中共鑒定出蛋白質(zhì)130種，ADPKD囊腫襯里上皮細胞中水平上調(diào)者35種，下調(diào)者61種。免疫學(xué)方法驗證顯示：SALB在ADPKD患者尿蛋白質(zhì)

7、組樣品與正常成人尿蛋白質(zhì)組樣品中免疫印跡條帶灰度比(1.18)和ICAT-2DLC-MS/MS分析提供的H：L(0.6904)存在差異。因此，選擇豐度水平上調(diào)超過100％及下調(diào)超過50％的蛋白質(zhì)(包括肽指紋僅見重試劑或輕試劑標記的單峰的蛋白質(zhì))作為差異蛋白，盡量避免2DLC-MS/MS以肽指紋峰面積比反映蛋白質(zhì)豐度比可能帶來的系統(tǒng)誤差。在接受豐度差異免疫學(xué)驗證的差異蛋白質(zhì)中，除lamininα2在囊腫襯里上皮細胞與正常腎小管上皮細胞中未

8、表現(xiàn)明顯差異外，其余蛋白質(zhì)在ADPKD尿液、血清蛋白質(zhì)組樣品或囊腫襯里上皮細胞中均顯示與ICAT-2DLC-MS/MS分析結(jié)果方向一致的豐度變化。 根據(jù)研究結(jié)果提示的信息，可以看到包括多囊蛋白-1在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)成分在ADPKD患者尿液、血清及囊腫襯里上皮細胞蛋白質(zhì)組中發(fā)生豐度改變，這些差異蛋白包括生長因子、凋亡調(diào)節(jié)蛋白、參與胞漿運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)、細胞外基質(zhì)成分、受體、細胞信號蛋白、酶類、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等，可能分別在囊腫襯里