應(yīng)用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)常染色體顯性遺傳多囊腎病基因.pdf

1、目的：常染色體顯性遺傳多囊腎病嚴(yán)重危害人類的健康，PKD1和PKD2基因突變所致基因序列閱讀框改變是引起常染色體顯性遺傳多囊腎病發(fā)生的重要原因。本研究擬用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)篩查常染色體顯性遺傳多囊腎病患者，對(duì)可能存在的缺失突變患者和重復(fù)突變患者做出輔助診斷。
　　 方法：選擇20例常染色體顯性遺傳多囊腎患者，經(jīng)B超或CT證實(shí)為多囊腎，抽取全血樣本；3例健康志愿者的血液樣本作為正常對(duì)照。采用血液基因組DNA提取試劑盒抽提全部實(shí)驗(yàn)

2、樣本的DNA。采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)所有樣本的PKD1基因和PKD2基因。多重連接探針擴(kuò)增結(jié)果顯示為單一外顯子擴(kuò)增或可疑擴(kuò)增的樣本，針對(duì)該外顯子設(shè)計(jì)引物，采取實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。多重連接探針擴(kuò)增結(jié)果顯示為單一外顯子缺失或可疑缺失的樣本，針對(duì)相應(yīng)的多重連接探針擴(kuò)增連接位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，采用普通PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證，若存在擴(kuò)增產(chǎn)物則進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：多重連接探針擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中,20例常染色體顯性遺傳多囊腎患者外周

3、血樣本的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)與同批次的正常樣本進(jìn)行對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)1 例外顯子缺失，5例外顯子疑似缺失，3例外顯子疑似重復(fù)，余為陰性。
　　 采用實(shí)時(shí)定量PCR方法、普通PCR方法及基因測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)6號(hào)樣本中PKD1基因第40外顯子有一個(gè)錯(cuò)義突變C11541A，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０罚ˋCC>AAC）；發(fā)現(xiàn)17號(hào)樣本PKD2基因第8外顯子發(fā)生缺失突變；在1例患者中發(fā)現(xiàn)重復(fù)突變，7號(hào)樣本PKD1基因6號(hào)外顯子的表達(dá)較正常

4、人上調(diào)3.839倍。
　　 結(jié)論：本研究在國(guó)內(nèi)率先使用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)對(duì)常染色體顯性遺傳多囊腎病患者進(jìn)行PKD1/PKD2基因外顯子缺失與擴(kuò)增篩查,建立了多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)常染色體顯性遺傳多囊腎病基因的實(shí)驗(yàn)方法，并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。在常染色體顯性遺傳多囊腎病的基因診斷中，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)既有其優(yōu)勢(shì)，也發(fā)現(xiàn)了一些局限性。
　　 實(shí)時(shí)定量PCR、普通PCR及基因測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，可使得PKD1/PKD2基因檢測(cè)更為