羅格列酮治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病中的機(jī)制：P38MAPK信號通路的作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)旨在探討P38MAPK信號通路在羅格列酮治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病中的重要作用及其可能機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察大鼠正常腎組織、多囊腎組織、羅格列酮治療后多囊腎組織中P38、磷酸化P38(P-P38)和NF-кB的分布及表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在自發(fā)突變的ADPKD動(dòng)物模型Han：SPRD大鼠腎臟組織中P38、P-P38和NF-кB表達(dá)均明顯高于正常對照大鼠，分布部位有一致性；三種抗體在正常腎小管上皮細(xì)胞主要分布于胞漿

2、，多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞中易位至細(xì)胞核內(nèi)，羅格列酮治療后可明顯減少其細(xì)胞核內(nèi)分布。Western blot和RT-PCR半定量檢測不同組織P38和P-P38表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P38和P-P38在多囊腎組織蛋白中表達(dá)明顯高于正常對照組(P<0.05)，純合子表達(dá)高于雜合子，雄性雜合子表達(dá)高于雌性雜合子，羅格列酮治療后可明顯減少P38和P-P38在多囊腎組織表達(dá)，由此可見P38和P-P38的表達(dá)與病情嚴(yán)重程度正相關(guān)，P38和核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB

3、與前期工作研究的TGF-β和MCP-1一樣在羅格列酮治療多囊腎病中發(fā)揮重要作用。 體外實(shí)驗(yàn)通過：主要在脂多糖(LP S)(10ug/ml)誘導(dǎo)炎癥的犬遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞(MDCK)中探討P38信號通路及羅格列酮與鈣離子和細(xì)胞因子TGF-β、MCP-1和NF-кB的關(guān)系。分別予羅格列酮(RGZ)不同劑量(0、10、20、50、100、200umol/L)及RGZ(10umol/L)、PPARγ抑制劑(GW9662)(10umol/

4、L)、RGZ+GW9662、P38特異性抑制劑SB203580(10 umol/L)、RGZ+SB203580、鈣離子螯合劑BAPTAM-AM(10umol/L)、RGZ+BAPTAM-AM預(yù)刺激細(xì)胞2小時(shí)后，予LPS刺激MDCK細(xì)胞。觀察各組： 1)Western blot檢測不同試劑刺激后P38、P-P38蛋白變化。 2)免疫細(xì)胞化學(xué)觀察TGF-β1、MCP-1表達(dá)。 3)RT-PCR檢測P38、TGF-β1

5、、MCP-1mRNA變化。 4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測NF-кB活性。 5)激光掃描共聚焦顯微鏡用FLUO-3AM鈣離子熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Western blot、RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示： ①LPS刺激MDCK細(xì)胞，P-P38在5分鐘后達(dá)到高峰，而P38于6小時(shí)后開始升高，12小時(shí)達(dá)高峰；為羅格列酮等不同試劑刺激細(xì)胞觀察P38和P-P38變化選擇刺激時(shí)間點(diǎn)提供依據(jù)。

6、 ②不同濃度羅格列酮分別作用于細(xì)胞，結(jié)果顯示羅格列酮明顯下調(diào)P38、P-P38表達(dá)，并與劑量相關(guān)，下調(diào)程度在50umol/L組最低，而100umol/L和200umol/L組對P38和P-P38下調(diào)程度較50umol/L組明顯減弱，并有活化P38趨勢。 ③RGZ、GW9662、RGZ+GW9662、SB203580、RGZ+SB203580、BAPTAM-AM、RGZ+BAPTAM-AM作用于細(xì)胞，結(jié)果顯示RGZ組、SB2

7、03580組、RGZ+SB203580組、BAPTM-AM組和RGZ+BAPTAM-AM組可明顯下調(diào)P38、P-P38及細(xì)胞因子TGF-β和MCP-1表達(dá)，其中RGZ+SB203580組與RGZ組相比下調(diào)程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示羅格列酮可能通過抑制P38活化和表達(dá)下調(diào)其下游因子TGF-β和MCP-1的表達(dá)；而BAPTM-AM組和RGZ+BAPTAM-AM組下調(diào)程度較RGZ組明顯增強(qiáng)，提示鈣離子可能并不參與羅格列酮對P38、P-P38及其下

8、游因子的調(diào)節(jié)過程；GW9662單用組對以上因子無影響，而RGZ+GW9662組可部分阻斷羅格列酮下調(diào)程度。 結(jié)論：羅格列酮可能通過減少P38表達(dá)和活化，繼之抑制MCP-1、TGF-β1表達(dá)和NF-кB活性改善多囊腎病中的間質(zhì)炎癥反應(yīng)和纖維化。羅格列酮的這些抑制作用是非鈣離子依賴的，部分是非PEARγ依賴的。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)高濃度羅格列酮可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，這可能參與其水潴留的副作用，可能成為研發(fā)新型PPARy激動(dòng)劑及聯(lián)合用藥新的