富含半胱氨酸酸性分泌糖蛋白在常染色體顯性多囊腎病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、常染色體顯性多囊腎病(Autosomaldominantpolycystickidneydisease，ADPKD)是人類最常見的致死性單基因遺傳病之一，發(fā)病率超過1‰。其特征是雙側(cè)腎臟形成多個大小不等的液性囊腫并進(jìn)行性增大，疾病逐漸進(jìn)展，約有50％患者在中年后期發(fā)展為終末期腎衰竭。ADPKD也常累及腎外器官，引發(fā)多囊肝、胰管及膽管擴(kuò)張、結(jié)腸憩室、顱內(nèi)動脈瘤、心臟瓣膜異常等。因其危害嚴(yán)重、缺乏有效的防治手段，已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病

2、之一。 該實驗室自1998年始致力于ADPKD發(fā)病機制、診斷和治療的一體化研究。在前期工作中，利用基因芯片技術(shù)比較了正常腎組織與多囊腎組織基因表達(dá)譜的變化，觀察到富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(secretedproteinacidicandrichincysteine，SPARC)在多囊腎組織中表達(dá)譜上調(diào)。SPARC又名骨結(jié)合素(Osteonectin)或BM-40(BoneMatrix)，是一種小分子細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，它可與細(xì)

3、胞因子、細(xì)胞膜表面蛋白及其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用而表現(xiàn)出抗增殖等多種生物活性。為了探討SPARC在多囊腎病發(fā)展中的作用，該文檢測了SPARC在ADPKD患者體液中的濃度，比較觀察了SPARC在多囊腎組織和正常腎組織的分布和表達(dá)差異，初步探討了尿液和囊液中SPARC的分泌來源，表達(dá)和純化了SPARC蛋白，并觀察了它在體外對人ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞的作用。 該研究由四部分組成。 一、SPARC在ADPKD患者體液中的定

4、量檢測、腎組織中的表達(dá)及其分泌研究 研究SPARC對ADPKD的作用，首先要明確ADPKD患者囊腫液中是否存在SPARC，SPARC在患者腎臟中的分布和表達(dá)及其可能的分泌來源。該研究分別以ADPKD患者和人ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞為研究對象，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定ADPKD患者和單純腎囊腫(SRC)患者血漿、尿液和囊腫液以及正常人血漿和尿液中的SPARC濃度，原位雜交和免疫組織化學(xué)方法研究SPARC在ADPKD患者以

5、及正常人腎組織中的定位，實時熒光定量RT-PCR和Westernblot方法定量檢測SPARCmRNA和蛋白在以上腎組織中的表達(dá)，Westernblot方法結(jié)合光密度分析定量檢測囊腫襯里上皮細(xì)胞和人腎小管細(xì)胞(humankidneycortex，HKC)培養(yǎng)液中的SPARC蛋白水平，初步證明患者尿液和囊液中的SPARC分泌來源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADPKD患者囊液中的SPARC濃度顯著高于SRC患者(P＜0.01)；ADPKD患者尿液中的SPA

6、RC濃度顯著高于SRC患者和正常對照組(P'＜0.01)，但SRC患者和正常對照組尿液中的SPARC濃度無顯著差異(P＞0.05)；三組血漿中的SPARC含量無顯著差異；ADPKD組中，囊液中的SPARC濃度與血漿和尿液中的SPARC濃度相比均有顯著性差異(P's＜0.01)，但SRC組中卻無這種現(xiàn)象。此外，患者腎組織中SPARCmRNA和蛋白水平都顯著高于正常腎組織，在正常成人腎組織中，SPARC在小管細(xì)胞僅有極微弱表達(dá)；在成人ADP

7、KD腎組織中，它主要強表達(dá)于囊腫襯里上皮細(xì)胞和擴(kuò)張的腎小管上皮細(xì)胞，表達(dá)水平強于未擴(kuò)張的小管細(xì)胞。HKC細(xì)胞和囊腫襯里上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中均檢測到SPARC蛋白，光密度檢測兩種細(xì)胞所分泌的SPARC蛋白與相應(yīng)的內(nèi)參(GAPDH)條帶光密度比值分別為35.56％和71.15％。SPARC是一種分泌性糖蛋白，其分子量(信號肽剪切后)為32kDa，理論上尿液中這些分子量為32kDa的小分子蛋白可能來自腎小球濾過，而且過去也有報道SPARC在尿道

8、和膀胱上皮均有表達(dá)。但該研究中所有ADPKD患者尿檢蛋白為陰性或微量，未發(fā)現(xiàn)明顯的膀胱和尿道病變。因此，該研究證實了ADPKD患者囊液和尿液中增多的SPARC可能來自囊腫襯里上皮細(xì)胞及擴(kuò)張的小管和集合系統(tǒng)。 二、rhSPARC的表達(dá)及純化 為了在體外深入研究患者囊液和尿液中增多的SPARC對ADPKD的作用，該文表達(dá)、純化了SPARC蛋白。提取ADPKD患者多囊腎組織總RNA，根據(jù)已知的SPARCcDNA序列(GenBa

9、nkY00755)，自行設(shè)計一對引物跨越SPARC成熟蛋白(信號肽除外)的N端酸性區(qū)、富含半胱氨酸的follistatin樣(FS)區(qū)和細(xì)胞外鈣結(jié)合(EC)區(qū)。用兩步法RT-PCR擴(kuò)增編碼SPARC成熟蛋白的cDNA片段，通過基因工程技術(shù)成功地將861bp的SPARCcDNA片段插入融合蛋白表達(dá)載體pPROEXHTb中，構(gòu)建了表達(dá)載體pPROEXHTb-SPARC，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序證實為所需要的質(zhì)粒后，將其轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL

10、21感受態(tài)細(xì)胞。異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)氨基端有6個連續(xù)組胺酸的融合蛋白，用Ni2+金屬螯合柱親和層析純化融合蛋白，并用分子篩SuperdexG75(26/60)精制。純化蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示出分子量為43kDa的融合蛋白，經(jīng)Westernblot鑒定為SPARC的6×His融合蛋白(相對分子量為32kDa，表觀分子量為43kDa)。表達(dá)純化的rhSPARC蛋白用于體外細(xì)胞學(xué)研究。

11、 三、rhSPARC對ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖的影響病理研究 已證實，ADPKD囊腫發(fā)生、發(fā)展的先決條件是囊腫襯里上皮細(xì)胞過度增殖，而該文建立的人ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞株，具有多囊腎病囊腫細(xì)胞的生物學(xué)特性。該研究利用ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞株為細(xì)胞實驗對象，探討了rhSPARC對該細(xì)胞系增殖的抑制作用和可能機制。體外條件下用不同濃度rhSPARC處理囊腫襯里上皮細(xì)胞，5-溴-2脫氧尿苷酶聯(lián)免疫吸附測定法(BrdU，

12、ELISA)測定囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，實時熒光定量RT-PCR方法檢測細(xì)胞周期調(diào)控基因ClnD1、P21Waf1和細(xì)胞增殖相關(guān)基因增殖細(xì)胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)、微型染色體維持蛋白2(minichromosomemaintenanceprotein2，MCM2)基因表達(dá)水平的變化，Westernblot檢測rhSPARC對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，免疫

13、細(xì)胞化學(xué)檢測rhSPARC對ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞c-fos和c-jun表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微克濃度的rhSPARC能有效抑制ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖(P＜0.01)，并呈一定的劑量和時間依賴關(guān)系。同時，SPARC使G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，增殖指數(shù)逐漸降低。囊腫細(xì)胞經(jīng)10μg/mlrhSPARC作用72小時后，PCNA和MCM2的mRNA水平顯著下降，ClnD1mRNA水平[(3.5

14、6±0.54)×104拷貝/百萬GAPDH]較對照組[(7.50±0.99)×104]顯著減弱(P＜0.01)，P21WaflmRNA水平[(7.72±0.85)×103]較對照組[(4.25±1.38)×103]顯著增強(P＜0.05)，c-fos和c-jun的表達(dá)受到明顯抑制。囊腫細(xì)胞經(jīng)不同濃度SPARC作用20分鐘后，隨著rhSPARC作用濃度升高，磷酸化P42/44MAPK的表達(dá)逐漸減弱。這說明rhSPARC能夠有效抑制囊腫襯里

15、上皮細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)展。其機制可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制了細(xì)胞周期調(diào)控基因ClnD1、促進(jìn)P21Waf1的表達(dá)，阻止細(xì)胞通過G1-S期限制點，從而對其增殖產(chǎn)生顯著的抑制效應(yīng)。 四、rhSPARC對ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞凋亡的影響 近年研究證實ADPKD囊腫細(xì)胞存在增殖與凋亡失衡。為了檢測外源性SPARC對囊腫襯里上皮細(xì)胞是否存在誘導(dǎo)凋亡的作用，該文利用透射電鏡觀察了rhSPARC對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，流式細(xì)

16、胞儀檢測了細(xì)胞凋亡指數(shù)的改變，實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測了rhSPARC作用后，囊腫襯里上皮細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2mRNA水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，囊腫細(xì)胞經(jīng)不同濃度rhSPARC(2.5、5和10μg/ml)作用48小時后，倒置顯微鏡下可見部分細(xì)胞由不規(guī)則形狀變成橢圓或圓形，部分由貼壁細(xì)胞變?yōu)閼腋〖?xì)胞，但細(xì)胞膜完整，以10μg/mlrhSPARC作用組最明顯。電鏡下可見典型的凋亡改變：胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡和溝裂，胞核

17、不規(guī)則，核染色質(zhì)濃縮并邊集，部分細(xì)胞可見典型的凋亡小體。流式細(xì)胞儀檢測到細(xì)胞G0/G1期前均出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，隨著rhSPARC作用濃度的升高，相應(yīng)凋亡峰的面積逐漸增加，凋亡指數(shù)顯著升高。同時Bcl-2mRNA水平顯著降低，致使Bcl-2/Bax比值明顯下調(diào)。因此rhSPARC可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達(dá)，使凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進(jìn)基因Bax之間的比值下調(diào)而誘導(dǎo)囊腫細(xì)胞凋亡。 總之，通過以上四

18、部分的研究，發(fā)現(xiàn)表達(dá)純化的rhSPARCSPARC能夠調(diào)節(jié)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞周期調(diào)控基因ClnD1、促進(jìn)P21Wafl的表達(dá)，抑制細(xì)胞通過G1-S期調(diào)控點，從而抑制囊腫襯里上皮細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)展，對其增殖產(chǎn)生顯著的抑制作用。rhSPARC還能夠調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達(dá)，使凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進(jìn)基因Bax之間的比值下調(diào)而誘導(dǎo)囊腫細(xì)胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)SPARC在ADPKD患者的腎組織和囊液中高表達(dá)，提示這