常染色體顯性多囊腎疾病行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的方法研究.pdf

1、目的： 常染色體顯性多囊腎疾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是人類最常見的單基因遺傳病之一，人群中的發(fā)病率為1/1000，是發(fā)病率最高的遺傳性腎病，居我國(guó)終末期腎衰竭病因的第4位。 引起ADPKD的突變基因有PKD1和PKD2，現(xiàn)認(rèn)為可能存在PKD3。PKD1是最常見的致病基因，定位于染色體16p13.3，基因長(zhǎng)度為47kb，含有46個(gè)外顯子。PK

2、D2基因定位于染色體4q21-23，基因長(zhǎng)度為70 kb，含有15個(gè)外顯子。PKD1和PKD2的蛋白產(chǎn)物為多囊蛋白，其異常是導(dǎo)致多個(gè)臟器特別是腎臟進(jìn)展性等多囊性改變的主要原因。ADPKD的主要表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟形成多個(gè)液性囊泡，囊腫進(jìn)行性增大，造成腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害，最終引起終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)。除了腎臟病變外，還累及全身多個(gè)器官，如肝囊腫、高血壓、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、心瓣膜畸形等，因此ADPKD

3、是一種全身性疾病。目前對(duì)ADPKD的治療尚無特異的治療措施，只是一些對(duì)癥治療和延緩多囊腎病向ESRD進(jìn)展的干預(yù)措施，多數(shù)患者最終將發(fā)展到終末期腎衰而不得不進(jìn)行腎臟替代治療和腎移植手術(shù)。 由于ADPKD延遲性發(fā)病的特點(diǎn)，平均發(fā)病年齡在40歲左右，其突變基因攜帶者在婚育年齡可能尚未發(fā)病，因此ADPKD攜帶者常低估ADPKD的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。由于ADPKD呈常染色體顯性遺傳，事實(shí)上50％的后代有ADPKD的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。近年來，胚胎植入前遺傳學(xué)

4、診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)已被成功應(yīng)用于ADPKD。PGD做為一種比傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷更早的診斷方法，對(duì)配子或著床前的胚胎進(jìn)行遺傳物質(zhì)分析，選擇沒有異常遺傳物質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植，既能防止患兒的產(chǎn)生，又能避免治療性流產(chǎn)和引產(chǎn)給夫婦雙方帶來生理和心理上的創(chuàng)傷。 由于PKD1和PKD2基因龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有較多的重復(fù)序列，突變的種類多，可能涉及整個(gè)基因，沒有突變熱點(diǎn)，因此進(jìn)行直接突變檢測(cè)

5、較為困難。本研究主要利用與PKD1緊密連鎖的KG8、SM6、CW4、CW2和與PKD2連鎖的D4S1534、D4S1563、D4S414、D4S423等8個(gè)微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記，先對(duì)多囊腎家系進(jìn)行遺傳學(xué)分析，找出與致病基因連鎖的微衛(wèi)星，而后用該微衛(wèi)星對(duì)廢棄胚胎的微衛(wèi)星分型結(jié)果進(jìn)行分析，以建立PKD1所致的ADPKD的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷方法。 方法： 1、獲取3個(gè)多囊腎家系成員的外周血，提取DNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)和毛細(xì)管

6、電泳對(duì)多囊腎家系成員進(jìn)行STR(short tandem repeats，STR)分型，包括與PKD1緊密連鎖的KG8、SM6、CW4、CW2和與PKD2連鎖的D4S1534、D4S1563、D4S414、D4S423的8個(gè)微衛(wèi)星，通過基因連鎖分析，找出與致病基因連鎖的微衛(wèi)星。對(duì)其中1個(gè)家系在行常規(guī)體外受精胚胎移植后的不適宜移植和冷凍的廢棄胚胎5個(gè)共15個(gè)卵裂球進(jìn)行了STR分型。 2、對(duì)2個(gè)志愿者提供的共64個(gè)淋巴細(xì)胞利用四重巢

7、式PCR和毛細(xì)管電泳對(duì)KG8、SM6、CW4和CW2四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行STR分型。 結(jié)果： 1、建立家系系譜圖，遵照孟德爾遺傳規(guī)律進(jìn)行基因連鎖分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)家系發(fā)病均由PKD1突變所致。 2、在家系的分析中，A-Ⅱ-1、A-Ⅱ-3、A-Ⅱ-4、A-Ⅱ-6、A-Ⅲ-1、B-Ⅱ-3、C-Ⅱ-1、C-Ⅱ-3和C-Ⅲ-1共9個(gè)SM6的STR分型結(jié)果和卵裂球的SM6的STR分型結(jié)果均不能由親代推導(dǎo)出，A-Ⅱ-3的D4S1563同

8、樣也發(fā)生了類似的現(xiàn)象，其余6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均出現(xiàn)此類情況?？紤]到SM6測(cè)序結(jié)果的不穩(wěn)定性，其可能不適合作為ADPKD的連鎖標(biāo)記。 3、5個(gè)廢棄胚胎的15個(gè)卵裂球9個(gè)行四重巢式PCR，7個(gè)擴(kuò)增成功，6個(gè)行雙重巢式PCR，均擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功率為86.67％(13/15)，未發(fā)現(xiàn)污染，SM6結(jié)果不能由親代推導(dǎo)出，有3個(gè)卵裂球的KG8位點(diǎn)出現(xiàn)ADO，而CW4與CW2未出現(xiàn)ADO。兩個(gè)胚胎攜帶致病基因。 4、單個(gè)淋巴細(xì)胞擴(kuò)增成功率

9、為85.93％(55/64)，SM6擴(kuò)增成功率為89.06％(57/64)，CW4擴(kuò)增成功率為92.18％(59/64)，CW2擴(kuò)增成功率為89.06％(57/64)，KG8位點(diǎn)的ADO率為25.64％(10/39)，CW4位點(diǎn)的ADO率為25％(4/16)，CW2位點(diǎn)的ADO率為7.01％(4/57)，均未發(fā)現(xiàn)污染。 5、單個(gè)卵裂球和單個(gè)淋巴細(xì)胞的CW2的STR結(jié)果均有酶鏈滑脫現(xiàn)象。 結(jié)論： 1、通過本研究，微

10、衛(wèi)星KG8、CW4、CW2、D4S1534、D4S1563、D4S414和D4S423可作為遺傳標(biāo)記對(duì)多囊腎家系進(jìn)行基因連鎖分析，本研究中單細(xì)胞四重巢式PCR擴(kuò)增成功率高，污染率低，等位基因脫扣率低，該方法為與PKD1連鎖的常染色體顯性多囊腎疾病的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷提供了可靠的依據(jù)。 2、SM6基因的STR測(cè)序結(jié)果的不穩(wěn)定性和微衛(wèi)星CW2的酶鏈滑脫現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究。 3、通過該實(shí)驗(yàn)研究，我們可以考慮為另兩個(gè)家系做胚胎