二代測序在胚胎植入前染色體疾病診斷中的臨床應用.pdf

1、研究背景：
　　染色體異常包括倍數(shù)改變、非整倍性改變、結(jié)構(gòu)改變和微小片段重復和缺失(≤10 Mb)等。染色體異常在臨床中與胚胎種植失敗、早期妊娠丟失、孕期引產(chǎn)甚至缺陷兒出生息息相關(guān)，因此有效地開展植入前遺傳學檢測(preimplantation genetictest,PGT)對保證不孕夫婦擁有健康的后代有重要意義。近十年，大多生殖中心采用芯片技術(shù)，如比較基因組雜交芯片(array comparative genomiohybri

2、dization，aCGH)和單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphismarray，SNP array)，進行PGT。近5年，二代測序(next generation sequencing，NGS)，如拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)，是一種新興的前沿技術(shù)，其臨床應用逐漸開展，并且在輔助生殖臨床工作中已經(jīng)證明對胚胎植入前遺傳學篩查(p

3、reimplantation genetic screening，PGS)和胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)有重要作用。PGS主要篩查染色體非整倍性改變。同時，臨床工作中由于一些小的片段的重復和缺失（≤10 Mb）導致產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)異常進而流產(chǎn)引起了我們的注意。目前，已經(jīng)有研究證明CNV-Seq在基因組水平診斷染色體疾病的價值，其在PGD和PGS中的價值也有探索，但很少有

4、關(guān)于CNV-Seq在細胞水平的重復性、分辨率以及與染色體疾病相關(guān)的微小重復、缺失的檢測的報道。因此我們確立了本研究:探索CNV-Seq在PGT領(lǐng)域全面檢測染色體疾病中的意義。
　　研究目的：
　　1.證實CNV-Seq在基因組水平診斷染色體疾病的價值及在33 pg稀釋基因組和單細胞水平診斷的穩(wěn)定性;
　　2.明確CNV-Seq在細胞水平的重復性、診斷異常時拷貝數(shù)(copy number，CN)cut-off點和細胞水平

5、的分辨率;
　　3.建立胚胎植入前活檢的細胞模型;
　　4.以CNV-Seq為主要診斷手段對尋求遺傳學診斷的不孕夫婦的胚胎進行染色體疾病的全面檢測。
　　研究方法：
　　1.在基因組水平，比較CNV-Seq和aCGH在檢測6個CNVs(6.52 Mb-93.02 Mb)的一致性，證實CNV-Seq在基因組水平診斷染色體疾病的價值。隨后進一步降低模板量到33 pg稀釋基因組和單細胞，進行全基因組擴增(whole g

6、enome amplification，WGA)，用產(chǎn)物作為測序文庫構(gòu)建的底物，探索33 pg稀釋基因組和單細胞水平診斷的穩(wěn)定性;
　　2.選用上一部分在三個水平都準確檢測到的6.52 Mb缺失和14.76 Mb的重復(aCGH診斷)作為研究樣本，用CNV-Seq為診斷手段在基因組水平進行3次重復，而后分別進行15次五細胞和單細胞WGA產(chǎn)物重復測序，統(tǒng)計不同水平的兩個已知異常區(qū)域拷貝數(shù)值(copy number value，CN

7、value)，各個水平差異以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，采用SPSS17.0軟件進行分析，三組之間用單向ANOVA，每兩組之間采用LSD-t檢驗進行分析，以α=0.05為檢驗水準，明確CNV-Seq診斷異常的CN值的cut-off點;
　　3.選擇5份凍存的外周血，包含6個從0.56 Mb到5.78 Mb大小不同的CNVs（基因組水平CNV-Seq已經(jīng)明確診斷）作為細胞來源，分別用五細胞和單細胞為底物進行WGA，并對其WG

8、A產(chǎn)物進行不同水平的三次重復測序，統(tǒng)計結(jié)果，進一步探索CNV-Seq在細胞水平的分辨率;
　　4.選擇中國人民解放軍總醫(yī)院生殖中心的有PGT指針且同意納入研究的7對夫婦的胚胎為觀察對象，以CNV-Seq為主要診斷手段進行診斷，檢測包括染色體非整倍體、非平衡易位和微小CNVs（≤10 Mb的重復和缺失），從而指導選擇平衡胚胎進行移植。
　　結(jié)果：
　　1.基因組水平在診斷6個CNVs時，CNV-Seq與aCGH診斷高度一

9、致，同時異常區(qū)域上升和下降趨勢顯著，并且能夠提供精確的位置信息。而用33pg稀釋基因組和單細胞WGA產(chǎn)物后，CNV-Seq也成功檢測到異常區(qū)域;
　　2.CNV-Seq對6.52 Mb缺失和14.76 Mb復制的檢測，在3次基因組水平和30次細胞水平的重復中，均成功地檢測到異常區(qū)域。兩個異常區(qū)域在基因組水平、五細胞水平和單細胞水平的CN值的Mean±SD分別1.01±0.03與2.96±0.03（基因組DNA),1.16±0.06

10、與2.75±0.10（五細胞），和1.13±0.10與2.69±0.13（單細胞）。SPSS17.0軟件分析后，三組差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，五細胞和基因組水平的差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，單細胞和基因組水平的差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，但兩個細胞水平之間的差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);
　　3.探索CNV-Seq在細胞水平的分辨率部分，針對6個從0.56 Mb到5.78 Mb大小不同的CNVs，分離單細胞

11、和五細胞，每個水平和每個CNV分別重復3次，共36次目標觀測檢測，除4次0.56 Mb和1次2.32 Mb高度重復區(qū)域之外，其余異常區(qū)域成功檢出;
　　4.在臨床研究中，7對夫婦共有35個囊胚進行活檢后的遺傳學診斷，其中18個為染色體非整倍性改變，1個為非整倍體合并4.98 Mb缺失(5q35.2-qter deletion，與Sotos syndrome相關(guān))，1個為6.66 Mb缺失(7pter-p22.1 deletion，

12、與7pterminal deletion syndrome相關(guān))，14個沒有明確致病性的CNVs（可進行胚胎移植）和1個因為WGA擴增失敗沒有得到結(jié)果。其中7對夫婦中，有5對至少有1個可供移植的胚胎。
　　結(jié)論：
　　1.CNV-Seq在診斷染色體疾病方面與aCGH有較高的一致性，且在細胞水平診斷有很好重復性和穩(wěn)定性;
　　2.成功構(gòu)建了胚胎活檢模型;
　　3.CNV-Seq在細胞水平診斷異常時CN值cut-of