二代測(cè)序在胚胎植入前染色體疾病診斷中的臨床應(yīng)用.pdf

1、研究背景：
　　染色體異常包括倍數(shù)改變、非整倍性改變、結(jié)構(gòu)改變和微小片段重復(fù)和缺失(≤10 Mb)等。染色體異常在臨床中與胚胎種植失敗、早期妊娠丟失、孕期引產(chǎn)甚至缺陷兒出生息息相關(guān)，因此有效地開展植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetictest,PGT)對(duì)保證不孕夫婦擁有健康的后代有重要意義。近十年，大多生殖中心采用芯片技術(shù)，如比較基因組雜交芯片(array comparative genomiohybri

2、dization，aCGH)和單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphismarray，SNP array)，進(jìn)行PGT。近5年，二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)，如拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)，是一種新興的前沿技術(shù)，其臨床應(yīng)用逐漸開展，并且在輔助生殖臨床工作中已經(jīng)證明對(duì)胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(p

3、reimplantation genetic screening，PGS)和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)有重要作用。PGS主要篩查染色體非整倍性改變。同時(shí)，臨床工作中由于一些小的片段的重復(fù)和缺失（≤10 Mb）導(dǎo)致產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)異常進(jìn)而流產(chǎn)引起了我們的注意。目前，已經(jīng)有研究證明CNV-Seq在基因組水平診斷染色體疾病的價(jià)值，其在PGD和PGS中的價(jià)值也有探索，但很少有

4、關(guān)于CNV-Seq在細(xì)胞水平的重復(fù)性、分辨率以及與染色體疾病相關(guān)的微小重復(fù)、缺失的檢測(cè)的報(bào)道。因此我們確立了本研究:探索CNV-Seq在PGT領(lǐng)域全面檢測(cè)染色體疾病中的意義。
　　研究目的：
　　1.證實(shí)CNV-Seq在基因組水平診斷染色體疾病的價(jià)值及在33 pg稀釋基因組和單細(xì)胞水平診斷的穩(wěn)定性;
　　2.明確CNV-Seq在細(xì)胞水平的重復(fù)性、診斷異常時(shí)拷貝數(shù)(copy number，CN)cut-off點(diǎn)和細(xì)胞水平

5、的分辨率;
　　3.建立胚胎植入前活檢的細(xì)胞模型;
　　4.以CNV-Seq為主要診斷手段對(duì)尋求遺傳學(xué)診斷的不孕夫婦的胚胎進(jìn)行染色體疾病的全面檢測(cè)。
　　研究方法：
　　1.在基因組水平，比較CNV-Seq和aCGH在檢測(cè)6個(gè)CNVs(6.52 Mb-93.02 Mb)的一致性，證實(shí)CNV-Seq在基因組水平診斷染色體疾病的價(jià)值。隨后進(jìn)一步降低模板量到33 pg稀釋基因組和單細(xì)胞，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole g

6、enome amplification，WGA)，用產(chǎn)物作為測(cè)序文庫構(gòu)建的底物，探索33 pg稀釋基因組和單細(xì)胞水平診斷的穩(wěn)定性;
　　2.選用上一部分在三個(gè)水平都準(zhǔn)確檢測(cè)到的6.52 Mb缺失和14.76 Mb的重復(fù)(aCGH診斷)作為研究樣本，用CNV-Seq為診斷手段在基因組水平進(jìn)行3次重復(fù)，而后分別進(jìn)行15次五細(xì)胞和單細(xì)胞WGA產(chǎn)物重復(fù)測(cè)序，統(tǒng)計(jì)不同水平的兩個(gè)已知異常區(qū)域拷貝數(shù)值(copy number value，CN

7、value)，各個(gè)水平差異以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，三組之間用單向ANOVA，每?jī)山M之間采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，明確CNV-Seq診斷異常的CN值的cut-off點(diǎn);
　　3.選擇5份凍存的外周血，包含6個(gè)從0.56 Mb到5.78 Mb大小不同的CNVs（基因組水平CNV-Seq已經(jīng)明確診斷）作為細(xì)胞來源，分別用五細(xì)胞和單細(xì)胞為底物進(jìn)行WGA，并對(duì)其WG

8、A產(chǎn)物進(jìn)行不同水平的三次重復(fù)測(cè)序，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，進(jìn)一步探索CNV-Seq在細(xì)胞水平的分辨率;
　　4.選擇中國人民解放軍總醫(yī)院生殖中心的有PGT指針且同意納入研究的7對(duì)夫婦的胚胎為觀察對(duì)象，以CNV-Seq為主要診斷手段進(jìn)行診斷，檢測(cè)包括染色體非整倍體、非平衡易位和微小CNVs（≤10 Mb的重復(fù)和缺失），從而指導(dǎo)選擇平衡胚胎進(jìn)行移植。
　　結(jié)果：
　　1.基因組水平在診斷6個(gè)CNVs時(shí)，CNV-Seq與aCGH診斷高度一

9、致，同時(shí)異常區(qū)域上升和下降趨勢(shì)顯著，并且能夠提供精確的位置信息。而用33pg稀釋基因組和單細(xì)胞WGA產(chǎn)物后，CNV-Seq也成功檢測(cè)到異常區(qū)域;
　　2.CNV-Seq對(duì)6.52 Mb缺失和14.76 Mb復(fù)制的檢測(cè)，在3次基因組水平和30次細(xì)胞水平的重復(fù)中，均成功地檢測(cè)到異常區(qū)域。兩個(gè)異常區(qū)域在基因組水平、五細(xì)胞水平和單細(xì)胞水平的CN值的Mean±SD分別1.01±0.03與2.96±0.03（基因組DNA),1.16±0.06

10、與2.75±0.10（五細(xì)胞），和1.13±0.10與2.69±0.13（單細(xì)胞）。SPSS17.0軟件分析后，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，五細(xì)胞和基因組水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，單細(xì)胞和基因組水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但兩個(gè)細(xì)胞水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);
　　3.探索CNV-Seq在細(xì)胞水平的分辨率部分，針對(duì)6個(gè)從0.56 Mb到5.78 Mb大小不同的CNVs，分離單細(xì)胞

11、和五細(xì)胞，每個(gè)水平和每個(gè)CNV分別重復(fù)3次，共36次目標(biāo)觀測(cè)檢測(cè)，除4次0.56 Mb和1次2.32 Mb高度重復(fù)區(qū)域之外，其余異常區(qū)域成功檢出;
　　4.在臨床研究中，7對(duì)夫婦共有35個(gè)囊胚進(jìn)行活檢后的遺傳學(xué)診斷，其中18個(gè)為染色體非整倍性改變，1個(gè)為非整倍體合并4.98 Mb缺失(5q35.2-qter deletion，與Sotos syndrome相關(guān))，1個(gè)為6.66 Mb缺失(7pter-p22.1 deletion，

12、與7pterminal deletion syndrome相關(guān))，14個(gè)沒有明確致病性的CNVs（可進(jìn)行胚胎移植）和1個(gè)因?yàn)閃GA擴(kuò)增失敗沒有得到結(jié)果。其中7對(duì)夫婦中，有5對(duì)至少有1個(gè)可供移植的胚胎。
　　結(jié)論：
　　1.CNV-Seq在診斷染色體疾病方面與aCGH有較高的一致性，且在細(xì)胞水平診斷有很好重復(fù)性和穩(wěn)定性;
　　2.成功構(gòu)建了胚胎活檢模型;
　　3.CNV-Seq在細(xì)胞水平診斷異常時(shí)CN值cut-of