羅氏診斷二代測序技術(shù)在hbv耐藥檢測中的應(yīng)用

1、羅氏診斷二代測序技術(shù)在HBV耐藥檢測中的應(yīng)用,,,羅氏診斷 應(yīng)用科學(xué)市場部 劉璐璐,HBV 耐藥性產(chǎn)生,病毒每天高速復(fù)制，并在復(fù)制時發(fā)生錯誤，這些自發(fā)突變導(dǎo)致突變株出現(xiàn)。突變株增殖能力通常低于野生型，因而在未用藥的群體中占少數(shù)。但在病毒藥物作用下，藥物對于耐藥性的突變有選擇作用，導(dǎo)致了耐藥菌株成為優(yōu)勢株，導(dǎo)致藥物治療的失敗。,www.454.com,耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測的意義治療前檢測，有助于臨床判斷用藥是否有效；

2、治療中每 3~6個月檢測，有助于觀察療效，及時調(diào)整用藥,EASL Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol, 2009, 50: 227-242.,用藥后出現(xiàn)耐藥,拉米夫定 阿德福韋酯 恩替卡韋 替比夫定

3、 替諾福韋,測序用于病毒耐藥檢測深度測序可檢出低頻準(zhǔn)種,提早判斷準(zhǔn)種組成，在劣勢菌種未發(fā)展成為優(yōu)勢菌種之前，即調(diào)整用藥策略；降低治療失敗可能性，減少對身體傷害。,454高深度測序優(yōu)勢,已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)對于RT基因區(qū)段1%突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，比目前常用的一代測序及線性探針反向雜交法更加靈敏進(jìn)行相對定量，對于病毒群體中突變數(shù)量改變進(jìn)行跟蹤深度測序的運(yùn)用將較傳統(tǒng)方法提前3-6個月檢測出突變，因此能夠更好的抓住治療的時機(jī)并給出治療的方案,—

4、,454測序系統(tǒng)發(fā)展測序通量及讀長不斷增加，大小測序平臺齊備,—,GS 20,GS FLX Standard,2005,2007,2008,—,,,Future,Even Longer Reads,Higher Density,Later,GS FLX Titanium,GS Junior Titanium,GS FLX+,2011,獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室適用型精巧型 二代測序平臺 GS Junior,GS Junior 測序步驟概覽,Mi

5、x ssDNA & capture beads,454 測序流程 文庫構(gòu)建,1. 454文庫構(gòu)建：Shotgun Paired-end300bp~1Kb, 3Kb, 8Kb, 20Kb*PCR產(chǎn)物可直接測序,傳統(tǒng)文庫構(gòu)建：BAC克隆->Shotgun/PCR,一個片段 = 一個反應(yīng)珠,454 測序流程 emPCR,2. emPCR每個DNA分子獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)后獨(dú)立測序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高GC含量片段、甚

6、至FFPE樣本,一個反應(yīng)珠 = 一個讀長,單克隆測序的價值通過 emPCR實(shí)現(xiàn)單克隆,直接閱讀每一種分子結(jié)果突變比例的計算（低頻）基于實(shí)際的序列信息每個DNA分子獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)后獨(dú)立測序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高 GC含量片段、甚至FFPE樣本,Sanger 流程-混合測序,454 流程-單克隆測序,454測序流程 測序,特異的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合, 加入一種dNTP DNA 聚合酶的作用下，單個 dNTP與模板的下一

7、個堿基配對，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi) 在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和APS結(jié)合形成ATP在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光，被CCD捕捉 Apyrase降解剩余的dNTP和殘留的少量ATP加入另一種dNTP重復(fù)2-5步驟在每一個測序循環(huán)里，堿基以同樣的次序(TACG)流過PicoTiterPlate板當(dāng)模板鏈的互補(bǔ)核苷酸加入延伸鏈時，會產(chǎn)生了熒光信號熒光信號強(qiáng)度

8、與所加入的核苷酸數(shù)目成比例熒光信號被CCD照相機(jī)記錄,熒光素酶,ATP 硫酸化酶,氧化熒光素,可見光,3. 基于焦磷酸反應(yīng)的邊合成邊測序,13,Sequencing By Synthesis,,,,,,,A A T C G G C A T G C T A A A A G T C A,,,,,C,T,A,Repeated d

9、NTP flow sequence:,G,G,T,C,A,G,T,C,A,G,T,T,T,T,C,A,G,G,A,T,C,C,C,G,A,T,T,G,C,T,A,Anneal Primer,Process continues until user-defined number of nucleotide flow cycles are completed.,邊合成邊測序,,實(shí)驗(yàn)體系的不斷優(yōu)化使得當(dāng)前可獲得Junior 平均為400bp

10、的讀長并將繼續(xù)以提升讀長為技術(shù)的發(fā)展方向之一,454測序流程 數(shù)據(jù)獲取,圖像處理,信號處理,454測序流程數(shù)據(jù)分析,測序與分析同時進(jìn)行，10小時完成10小時產(chǎn)出 10萬條以上的序列自帶4套軟件，滿足多數(shù)應(yīng)用需求軟件自動過濾，高質(zhì)量序列比例高400bp 的位置仍可保持Q20的準(zhǔn)確性,,GS Junior在德國大腸桿菌事件中Nicholas J Loman et al., Performance comparison of

11、benchtop high-throughput sequencing platforms, Nature Biotechnology, 2012 [DOI: 10.1038/nbt.2198]454 GS Junior擁有最長的讀長，平均讀長在522個堿基，99%的序列可以用于基因組拼接6月3日收到樣本，6月5日完成全部測序與機(jī)制確認(rèn)工作數(shù)據(jù)分析僅由HPA的非專業(yè)生信團(tuán)隊，不到半天時間即得到結(jié)果,www.454.com,序列讀長

12、分布圖,Junior 測序系統(tǒng)運(yùn)行產(chǎn)生的讀長范圍為50-600bp，甚至更長 shot gun實(shí)驗(yàn)將利用幾乎全部數(shù)據(jù)平均讀長為400bp典型讀長在 450-550bp范圍 Amplion 實(shí)驗(yàn)將主要根據(jù)典型讀長進(jìn)行PCR引物設(shè)計,CGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCT,Complex,,,Short read techno

13、logy,454 長測序能夠帶來什么emPCR 保證樣本的獲得，長焦磷酸確保閱讀,長讀長的價值,一條reads通讀一個目標(biāo)序列，無需拼接，避免錯誤產(chǎn)生與時間消耗通過一條reads判斷突變的連鎖關(guān)系更少引物獲得更多目標(biāo)引物設(shè)計的區(qū)間更靈活Junior1條reads 既可通讀HBV耐藥相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物,The Journal of Infectious Disease, May 2009; 199(9): 1275-85.,

14、PCR擴(kuò)增子文庫的設(shè)計長讀長給予更多引物設(shè)計空間，1條reads通讀熱點(diǎn)突變區(qū)域,454 B-primer (19 bp),,Locus specific PCR amplification,emPCR & 雙向測序,,Target specific sequence (ca. 25 bp),,454 A-primer (19 bp),,,,,,,,,,,,,,,,,,,Sequence of interest,,200 –

15、400 bp,通過MID序列，可以混合多個樣本測序同時測序,,Data analysis,RT基因可設(shè)計3個PCR產(chǎn)物片段S基因可設(shè)計2個PCR產(chǎn)物片段C基因可設(shè)計1個PCR產(chǎn)物片段X基因可設(shè)計1個PCR產(chǎn)物片段Pre-C基因可設(shè)計1個PCR產(chǎn)物片段,454測序在HBV 耐藥基因測序的應(yīng)用方案,454 測序步驟HBV耐藥檢測應(yīng)用,emPCR(乳滴PCR)擴(kuò)增每一帶有MID與測序引物的HBV耐藥突變高發(fā)DNA片段在其各自的微乳

16、滴中進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，排除了其它競爭性或污染性序列對 PCR反應(yīng)的影響。焦磷酸測序?qū)⑺薪Y(jié)合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中進(jìn)行測序。PTP板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。將PTP板置于GS測序儀中，單個核苷酸依次流經(jīng)孔洞和DNA捕獲磁珠間。當(dāng)所加入的核苷酸與模板互補(bǔ)時，便產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，進(jìn)而被GS系統(tǒng)的CCD相機(jī)記錄。,454的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測單點(diǎn)突變,454的分析結(jié)果呈現(xiàn)可關(guān)注已知突變,Mul

17、tiple Mutations in a Codon Associated with NRTI Resistance,,,T69,Confidential,Multiple Mutations in a Codon Associated with NRTI Resistance,,Thr69 ? 35% Alanine, 42% Asparagine, and 1.2% Serine,,,,Confidential,454的分析結(jié)果

18、呈現(xiàn)可檢測有意義的連鎖突變位點(diǎn),已有RT基因突變數(shù)據(jù)庫Standford HBVSeq,www.454.com,Standford HBVSeq結(jié)果展示,www.454.com,近兩年使用454 發(fā)表HBV耐藥檢測文獻(xiàn),Analysis of hepatitis B virus drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep pyrosequencing. Ko SY, Oh HB, P

19、ark CW, Lee HC, Lee JE. (2012) Clin Microbiol Infect ePub:Ultra-deep pyrosequencing detects conserved genomic sites and quantifies linkage of drug-resistant amino Acid changes in the hepatitis B virus genome. Rodriguez-

20、Frías F, Tabernero D, Quer J, Esteban JI, Ortega I, Domingo E, Cubero M, Camós S, Ferrer-Costa C, Sánchez A, Jardí R, Schaper M, Homs M, Garcia-Cehic D, Guardia J, Esteban R, Buti M. (2012) PLoS One 7

21、(5):e37874.Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencing in a chronic hepatitis B virus (HBV)-infected patient exposed to several unsuccessful therapy schemes. Sede M, Ojeda D, Cassino L, Westergaard

22、 G, Vazquez M, Benetti S, Fay F, Tanno H, Quarleri J. (2012) Antiviral Research ePub:Ultra-deep pyrosequencing analysis of the hepatitis B virus preCore region and main catalytic motif of the viral polymerase in the sam

23、e viral genome. Homs M, Buti M, Quer J, Jardí R, Schaper M, Tabernero D, Ortega I, Sanchez A, Esteban R, Rodriguez-Frias F. (2011) Nucleic Acids Research ePub:,GS Junior測序系統(tǒng)您身邊的二代測序平臺,,經(jīng)典可靠：運(yùn)用454測序技術(shù)，與GS FLX測序系統(tǒng)相同