含有ADV耐藥突變的HBV聚合酶RT區(qū)的原核表達(dá)及耐藥檢測研究.pdf

1、背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒，其感染仍是世界范圍內(nèi)慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要成因，嚴(yán)重危害人類健康，而治療慢性乙型肝炎的首要目標(biāo)是持久抑制病毒的復(fù)制。阿德福韋酯(Adefovir，ADV)是目前被批準(zhǔn)治療慢性乙型肝炎的一種核苷類似物藥物，通過抑制HBV聚合酶(HBV Polymerase，HBV-Pol)的活性來抑制病毒復(fù)制，但是長期治療會發(fā)生耐藥導(dǎo)致治療失敗。
　　HBV

2、聚合酶主要分成四個結(jié)構(gòu)域：N末端蛋白區(qū)(TP)，間隔區(qū)(SD)，逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(Reverse Transcriptase，RT)，核糖核酸酶(RNaseH)區(qū)。該蛋白同時具有DNA聚合酶和RNaseH酶活性，直接參與了HBV基因組的復(fù)制。HBV繁殖速度快，但其DNA聚合酶缺乏糾錯能力，復(fù)制過程中有大量突變發(fā)生，使得藥物與HBV聚合酶的親和力下降，進(jìn)而導(dǎo)致藥物抑制病毒復(fù)制的作用明顯減弱，其中HBV聚合酶RT區(qū)域的rtN236T和rtA181

3、T/V變異是與阿德福韋耐藥有關(guān)的常見變異位點[6,7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，一些患者在長期使用同一種抗病毒藥物治療過程中會發(fā)生病毒載量的“反跳”，先前的藥物已經(jīng)不能抑制病毒的復(fù)制?？梢娤惹坝盟幵斐傻耐蛔兡芨淖兒罄m(xù)的治療方案和治療效果。因此開展對HBV聚合酶RT區(qū)域功能的研究和對ADV等核苷類似物引起的耐藥進(jìn)行實時監(jiān)測尤為必要。
　　目的：本課題一方面擬通過表達(dá)純化HBV聚合酶RT區(qū)蛋白，來探索ADV抑制RT的機(jī)制；另一方面嘗試建立一種快

4、速、靈敏、特異檢測ADV耐藥突變株的方法，實現(xiàn)實時監(jiān)測ADV耐藥突變的發(fā)生，為后續(xù)治療方案的調(diào)整提供依據(jù)。
　　方法：1：以臨床慢性乙肝患者血清中的HBV DNA為模板，克隆HBV聚合酶RT區(qū)到原核表達(dá)載體pHis-SUMO載體上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒SUMO-RTWT，進(jìn)一步通過定點突變構(gòu)建含有阿德福韋耐藥突變位點(181T/V+236T)的原核表達(dá)質(zhì)粒SUMO-MT1和SUMO-MT2，原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Weste

5、rn blot鑒定，并進(jìn)行原核表達(dá)條件的優(yōu)化和HBV聚合酶RT區(qū)域的結(jié)構(gòu)建模。2：利用反向雜交技術(shù)原理設(shè)計特異性肽核酸探針，通過氨基酸偶聯(lián)在尼龍膜基質(zhì)上，通過一系列優(yōu)化實驗，包括探針濃度，雜交條件，洗脫條件等進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳反應(yīng)條件，能特異性檢測常見的ADV耐藥突變位點；利用構(gòu)建的含有ADV耐藥位點的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒株完成方法學(xué)評價，同時通過臨床樣本對檢測指標(biāo)(靈敏度、準(zhǔn)確性和精確度)的評價。
　　結(jié)果：通過分子克隆的技術(shù)，成功克隆、