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文檔簡介
1、目的:通過對臨診乙型肝炎病毒(Hepatisis B Virus,HBV)感染陽性患者所攜帶HBV基因組DNA(Genomic DNA,gDNA)的反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase,RT)區(qū)進(jìn)行調(diào)查,以期發(fā)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)有義變異位點(diǎn),從而推斷其變異與抗HBV藥物的相關(guān)性,為發(fā)現(xiàn)HBV新的耐藥位點(diǎn)及臨床抗HBV用藥提供新的素材和理論參考;選取典型變異樣本的HBV gDNA,構(gòu)建其RT活性區(qū)的重組克隆,轉(zhuǎn)染細(xì)胞并經(jīng)間接免疫
2、熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測其表達(dá)活性,為構(gòu)建其永久表達(dá)細(xì)胞系做準(zhǔn)備,同時(shí)為研究HBV變異與耐藥性奠定基礎(chǔ)。
方法:⑴選取從2011年4月至2011年12月在泰安八十八醫(yī)院用核苷(酸)類藥物治療的慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)大三陽患者,取其全血并分離血清,-80℃標(biāo)記凍存。⑵采用BIOMIGA公司血液基因組DNA提取試劑盒從保存的血
3、清中分離、純化HBV gDNA。⑶取經(jīng)PCR擴(kuò)增HBV S基因片段為陽性的核酸樣本,用互為重疊的兩對引物經(jīng)PCR分兩段擴(kuò)增HBV DNA全長基因(分為f1、f2兩部分)。⑷將擴(kuò)增出的f1、f2片段PCR產(chǎn)物分別與原核載體pMD18 T vecter連接,分別命名為T-f1、T-f2,在固體培養(yǎng)皿上長出的優(yōu)勢抗性菌落,經(jīng)初步特異性檢測為陽性的克隆菌落后測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行拼接,比對,校正,分析HBV基因核苷酸差異、變異類型。⑸選取一例H
4、BV RT區(qū)發(fā)生經(jīng)典變異的樣本,并以該樣本T-f1、T-f2為模板,設(shè)計(jì)含有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物,擴(kuò)增回收RT片段,與克隆載體pMD18 Tsimple vecter連接,測序驗(yàn)證后,將RT片段酶切回收,亞克隆入pcDNA3.1(-)中,構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pc-RT。⑹用200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml6個(gè)新霉素濃度梯度作用于CHO細(xì)胞,鏡
5、下觀察選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低新霉素濃度。⑺將重組質(zhì)粒pc-RT在陽性脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,6小時(shí)后加入帶有新霉素篩選濃度的培養(yǎng)液,24小時(shí)后檢測RT區(qū)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。⑻對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用大三陽陽性血清介導(dǎo)的IFA和Western blot檢測HBV RT區(qū)蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:①在P區(qū)基因的反轉(zhuǎn)錄酶區(qū),有幾處需關(guān)注的變異情況(兩例及以上出現(xiàn)的變異),可能為引起CHB患者耐藥變異的位點(diǎn)。②經(jīng)濃度梯
6、度遞倍稀釋等篩選,最后確定CHO細(xì)胞對新霉素的最佳篩選濃度為700ug/ml。③IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在熒光顯微鏡下,陽性表達(dá)細(xì)胞在70%以上。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HBV RT區(qū)蛋白在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)。
結(jié)論:⑴上述慢性乙型肝炎患者應(yīng)用核苷(酸)類藥物治療過程中,P區(qū)出現(xiàn)幾處需關(guān)注的變異情況,有5例樣本與已報(bào)道的HBV RT區(qū)經(jīng)典變異位點(diǎn)相同,有6處氨基酸變異與已證實(shí)的位點(diǎn)有所不同,初步發(fā)現(xiàn)了與HBV耐
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