藥敏試驗及耐藥檢測

1、,歡迎同學們學習實驗診斷學,2024/2/27,1,感染性疾病的實驗診斷--藥敏試驗及耐藥檢測,,2024/2/27,3,重點掌握,,1,常用的藥敏試驗方法,※,※,,2,藥敏試驗結(jié)果表示及其臨床意義,※,※,2024/2/27,4,,,藥敏結(jié)果的表示及其臨床意義,耐藥菌檢測試驗,抗微生物藥物敏感性試驗,耐藥機制,耐藥菌歷史,主要內(nèi)容,2024/2/27,5,Antibiotic Resistance

2、 A Global Problem,1961 — MRSA1967 — PRSP1983 — ESBLS1986 — VRE1988 — MBL1997 — VISA2002 — VRSA Emergence → Spread,2024/2/27,6,,耐藥機制,1、遺傳學機制染色體介導的耐藥　為細菌本身所固有的耐藥，一般具有種屬特異性，如腸球菌耐頭孢菌素，革蘭陰性桿菌耐萬古霉素等

3、。質(zhì)粒介導的耐藥　耐藥基因易于傳播，目前該類耐藥在臨床上占有重要地位。如由質(zhì)粒介導的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。,2024/2/27,7,2.生物化學機制產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶使抗生素失活。如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶。作用靶位的改變使抗生素失去作用位點。如MRSA產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白2a。主動外排機制　如銅綠假單胞菌其外膜存在著獨特的藥物泵出系統(tǒng)。細菌生物膜的形成。,耐藥機制

4、,2024/2/27,8,,2024/2/27,9,抗菌藥物敏感性試驗（antimicrobial susceptibility test AST）,簡稱藥敏試驗，是指在體外測定抗菌藥物抑制或殺菌的能力的實驗藥敏試驗用抗菌藥物的分組 CLSI將抗菌藥物分成A、B、C、U、O、Inv六個主要組別 A組（一級試驗并常規(guī)報告藥物） B組（一級試驗，有選擇報告藥物） C組（補充試驗，有選擇報告藥物） U組（僅用

5、于泌尿道的補充試驗藥物） O組（有適應癥，不允許常規(guī)試驗并報告藥物） Inv組（處于研究階段，未被FDA認可藥物）,,常規(guī)藥敏試驗報告藥物為前四種,2024/2/27,10,腸球菌A組：氨芐西林、青霉素B組：達托霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/達福普汀、萬古霉素 C組：高水平慶大霉素、鏈霉素U組：環(huán)丙、左氧、諾氟沙星、呋喃妥因、四環(huán)素,2024/2/27,11,銅綠假單胞菌A組：頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、哌

6、拉西林B組：阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、環(huán)丙、左氧、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦，替卡西林 U組：洛美或氧氟沙星、諾氟沙星,2024/2/27,12,常用藥敏試驗的方法,體外AST包括：※抑菌試驗：紙片擴散法 稀釋法 E-test聯(lián)合藥敏試驗全自動藥敏檢測系統(tǒng),2024/2/27,13,紙片擴散法（改良Kirby-Ba

7、uer法，K-B法）,將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍區(qū)域擴散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負相關，即抑菌圈越大，MIC越小。根據(jù)CLSI標準，對量取的抑菌圈直徑判斷病原菌對該藥物的敏感S/中介I/耐藥R。,2024/2

8、/27,14,下一張有視頻呦！,2024/2/27,15,源 http://v.ku6.com/show/MVioGWfEmjxJOMQDpChF5w.html,,2024/2/27,16,,,,,紙片擴散法操作簡易，結(jié)果直觀易于理解，但非定量結(jié)果，且對慢生長菌和擴散慢的藥物紙片法不適用。,2024/2/27,17,稀釋法 Dilution antimicrobial susceptibility test,直接測定抗菌藥物的最低抑菌

9、濃度（minimal inhibitory concentration, MIC)稀釋法包括兩種：肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法?；驹恚涸谌鉁颦傊袑⒖咕幬镞M行一系列（倍比）稀釋后，定量接種待實驗菌，在合適的溫度下孵育一定時間，待檢菌肉眼未見生長的最小藥物濃度，即為該藥物對待檢菌的最低抑菌濃度。試驗菌的結(jié)果報告可用MIC(μg/ml)數(shù)值或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告。,2024/2/27,18,,儀器,手工,,,20

10、24/2/27,19,濃度梯度紙條擴散法（E test）,是一結(jié)合稀釋法和擴散法原理對細菌藥敏試驗直接定量的技術(shù)。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度，又稱抑制濃度(IC)，它與MIC呈高度相關。二者直接相對應，CLSl的 MIC折點值適用于E試驗。具體操作視頻請點擊這里,2024/2/27,20,要連接網(wǎng)絡才能觀看呦,,,2024/2

11、/27,21,聯(lián)合藥敏試驗,此實驗是為了了解兩種抗菌藥物聯(lián)合應用時的抗菌效果。聯(lián)合藥敏試驗的結(jié)果可以表現(xiàn)為無關、拮抗、相加、協(xié)同。協(xié)同作用是臨床和實驗室期盼的結(jié)果。協(xié)同用藥最典型的例子是青霉素或其同類物與氨基糖苷類抗生素聯(lián)合治療腸球菌感染心內(nèi)膜炎。,2024/2/27,22,抗菌藥物聯(lián)合應用目的在于： ①治療單一用藥可能不能控制的混合感染 ②治療單一抗菌藥物不能有效控制的嚴重細菌感染 ③治療病因未明的嚴重感

12、染 ④預防或推遲細菌抗生素耐藥性的發(fā)生 ⑤減少藥物的毒性反應,2024/2/27,23,耐藥菌檢測試驗,1、直接β內(nèi)酰胺酶試驗目前多采用色原法，以頭孢硝噻吩為底物，直接與試驗菌作用，紙片由黃色變?yōu)榧t色為陽性。檢測陽性結(jié)果表明：該細菌對所有對青霉素酶不穩(wěn)定的青霉素（包括青霉素和廣譜青霉素）耐藥。需要對葡萄球菌、腸球菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌等常規(guī)檢測。,,,2024/2/27,24,2、超廣譜β內(nèi)酰胺酶的檢測（e

13、xtanded spectrum beta-lactamases, ESBLs）ESBLs由革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生，質(zhì)粒編碼，其活性可被β內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制，可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合、轉(zhuǎn)移等方式傳遞，易于造成耐藥菌流行。檢測包括紙片法篩查和確證試驗。產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌屬、大腸埃希菌和奇異變形桿菌應報告對所有青霉素類、頭孢菌素類（包括頭孢吡肟）以及氨曲南耐藥，但不包括頭霉素、碳青霉烯類和含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復合制劑。,2024/2/2

14、7,25,,腸桿菌科細菌ESBLs的檢測,2024/2/27,26,KPC酶能水解除頭霉素外的各種β內(nèi)酰胺類抗生素，可由腸桿菌科細菌產(chǎn)生。改良Hodge試驗,3、KPC（Klebsiella pneumoniae carbapenemase）酶的檢測,2024/2/27,27,4、耐甲氧西林葡萄球菌（methicillin resistance staphylococci, MRS）篩選MRS多是MecA基因編碼了對β-內(nèi)酰胺類藥

15、物低親和力的蛋白PBP2a，取代了固有的青霉素結(jié)合蛋白PBPs。MRS的簡便檢測方法是用頭孢西丁紙片擴散法，要基于頭孢西丁的結(jié)果報告苯唑西林敏感或耐藥。 MRS不論其體外藥敏試驗結(jié)果如何，其對所有的β-內(nèi)酰胺類藥物和β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均無臨床療效；絕大多數(shù)的MRS具有多重耐藥性，包括氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類、四環(huán)素類。臨床治療MRSA引起的感染首選萬古霉素。,2024/2/27,28,,葡萄球菌mec-A介導的耐藥性檢測

16、,頭孢西丁,,2024/2/27,29,5、耐青霉素肺炎鏈球菌檢測試驗（penicillin resistance streptococcus pneumonia, PRSP） K-B法 OX<19 mm時做青霉素MIC≧2 μg/ml,2024/2/27,30,6、高水平氨基糖苷類耐藥的腸球菌（high-level aminoglycosde resistance, HLAR） K-B法 慶大霉素120μg，出現(xiàn)

17、中介結(jié)果（7-9 mm）需補做MIC進行確證。,2024/2/27,31,7、萬古霉素耐藥的腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus）VRE 對萬古霉素耐藥主要有5種表型VanA、VanB、VanC、VanD和VanE，除VanC為天然耐藥外，其余均為獲得性耐藥。VanA、VanB可通過質(zhì)粒將耐藥性傳遞給其他腸球菌或其他種類的細菌，若傳遞給MRSA，則會導致VRSA的出現(xiàn)。VRE的簡便檢測方法是用紙

18、片擴散法，對于中介的結(jié)果（15-16mm）需補做MIC。,2024/2/27,32,8、克林霉素誘導耐藥試驗（D-實驗）克林霉素能被紅霉素誘導產(chǎn)生耐藥，靠近紅霉素紙片的克林霉素紙片抑菌圈出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，像字母D。檢測葡萄球菌,2024/2/27,33,藥敏試驗結(jié)果的表示及其臨床意義,結(jié)果的表示方法只是對抗菌藥物臨床治療效果的一種預測。敏感(susceptible,S)：表明該菌株所致感染可使用此種抗微生物藥物常規(guī)劑量進行治療，除

19、非存在禁忌證。耐藥(resistant,R)：耐藥是指即使使用大劑量的抗菌藥物治療時，該抗菌藥在感染部位也不能抑制該感染菌生長。,※,2024/2/27,34,中介(intermediate,I)：①抗菌藥對感染菌的MIC接近該藥在血液和組織中通?？蛇_到的濃度，感染菌的臨床應答率可能低于敏感菌。②意味著某些藥物在生理濃集的部位(如尿液中的喹諾酮類和β內(nèi)酰胺類)具有臨床效力，或者可用。③若某藥在高劑量使用時是安全的(如β內(nèi)酰胺類)

20、，則中介意味著高于通常劑量的藥物進行治療可能有效。④中介還意味它是一個緩沖區(qū)，避免微小的、未能控制的技術(shù)因素造成重大的結(jié)果解釋錯誤，特別是對那些藥物毒性范圍窄的藥物。,藥敏試驗結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,35,劑量依賴敏感(susceptible-dose dependent,SDD) 是指抗菌藥對感染菌的MIC接近該藥在血液和組織中通?？蛇_到的濃度，感染菌的臨床應答率可能低于敏感菌；當高劑量使用該藥仍然安

21、全時，則高劑量給藥可能有效。這個概念主要用于真菌的藥敏試驗，類似于細菌藥敏試驗的“中介”。,藥敏試驗結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,36,不敏感(nonsusceptible,NS) 當某新的抗菌藥問世時，由于尚未發(fā)現(xiàn)耐藥株，故早期的解釋標準只有敏感折點；當某個分離株的MIC值高于該敏感折點時，就報告為不敏感。,藥敏試驗結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,37,簡而言之：S 表明推薦的抗菌藥物可以使

22、用，可能達到臨床效果；I 意味著這個范圍的抗菌藥物在常規(guī)劑量下療效不理想，高濃度下可能有效；R 意味著此種情況下抗菌藥物不能用于此菌株的治療。,藥敏試驗結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,38,SUMMIT,常用的藥敏試驗方法：紙片擴散法、稀釋法、E-test、聯(lián)合藥敏試驗、全自動藥敏檢測系統(tǒng)藥敏試驗結(jié)果表示及其臨床意義S 表明推薦的抗菌藥物可以使用，可能達到臨床效果；I 意味著這個范圍的抗菌藥物在常規(guī)劑量下療效不

23、理想，高濃度下可能有效；R 意味著此種情況下抗菌藥物不能用于此菌株的治療。SDD 真菌的藥敏試驗，類似于細菌藥敏試驗的“中介”NS MIC值高于該敏感折點時，就報告為不敏感,2024/2/27,39,參考文獻,藥理學. 人民衛(wèi)生出版社 第2版.實驗診斷學. 人民衛(wèi)生出版社 第2版.實驗診斷學. 北京大學醫(yī)學出版社 第3版.臨床微生物學檢驗. 人民衛(wèi)生出版社 第5版.全國臨床檢驗操作規(guī)程. 人民衛(wèi)生出版社 第4版.M100