二代測序(ngs)實驗方案和應(yīng)用

1、這里為您介紹二代測序的相關(guān)流程和應(yīng)用。隨著人類基因組工程的完成，對于低花費的測序技術(shù)的需求促進了高通量二代測序技術(shù)的發(fā)展。這些新的測序平臺允許進行高通量測序，具有廣泛的應(yīng)用：?全基因組從頭測序或者重測序?目標序列重測序?轉(zhuǎn)錄組分析?微生物組研究?基因調(diào)控研究NGS序列二代測序儀器有很多種組合，在通量、片段長度、準確度、每一輪測序成本、每百萬堿基對測序成本、初始成本、規(guī)格和技術(shù)方面存在存在差異。從規(guī)格和初始成本的角度而言，二代測序儀器可輕

2、松地分類為更窄的范圍，也就是所謂的“臺式測序儀”和高通量儀器。臺式測序儀使得任何實驗室都可以像使用realtimePCR一樣，自己進行測序。這些儀器可以和一些靶標序列富集技術(shù)相結(jié)合，用在一些臨床的應(yīng)用中，其中：選定的靶標基因用于深度分析，以檢測稀有的突變，或者檢測多樣樣本中（比如癌癥樣本）中的突變。目前，這些儀器的通量在10Mb到7.5Gb之間，但是隨著硬件，軟件和試劑的持續(xù)改善，通量也在穩(wěn)步增加。高通量測序儀非常適合于大量的，基因組范

3、圍的研究，每次測序能測定600Gb的序列。一些這樣的高通量和高精度的平臺，能測定的片段長度相對較短，這對于高重復(fù)性的序列和未知基因組的從頭測序就可能成為問題。與此相反，也有一些儀器能測序的片段較長（達到2500bp），但是其精度和測序能力（90Mb）要低很多。還有一些測序能力位于兩者之間的儀器（~800bp，700Mb）。因此，應(yīng)用決定了哪一種儀器是最合適的。有一種新的方法被稱作“納米孔測序”。這種技術(shù)中，根據(jù)一個DNA鏈通過一個合成的

4、或者蛋白納米孔道所引起的電流的改變，可以確定通過這個孔道的堿基。這理論上可以僅用一步就測序一個完整的染色體，而不需要生成新的DNA鏈。DNA測序二代DNA測序的工作流程如下：?DNA樣本制備?文庫構(gòu)建和驗證?文庫分子大規(guī)模平行克隆擴增?測序二代測序DNA樣本的質(zhì)量控制首先，評價基因組DNA的質(zhì)量是非常必要的（完整性和純度）。凝膠電泳法對于大多數(shù)商業(yè)化的二代測序平臺，使用諸如橋式擴增或者乳液PCR方法，對文庫中的DNA片段進行克隆擴增，以

5、產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測序模板非常必要。通過將平臺特異性的適配子與感興趣的DNA源（比如基因組DNA、雙鏈cDNA或者PCR擴增子等所產(chǎn)生的DNA片段）退火，得到片段文庫。適配子序列的存在，使得我們可以對文庫分子進行選擇性的克隆擴增。因此，這種方法不需要像傳統(tǒng)的方法那樣，在微生物中間體中，對基因組片段進行微生物克隆。另外，適配子序列中，還含有平臺特異性的測序引物的結(jié)合位點。通常情況下，一個常規(guī)的DNA文庫構(gòu)建方案包含四步：?片段化DNA?對

6、DNA片段進行末端修復(fù)?連接適配子序列（不適用于單分子測序）?對可選的文庫進行擴增目前有四種方法用于產(chǎn)生基因組DNA碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動力剪切法。這四種方法都可以用于文庫構(gòu)建，但是每一種方法都有其優(yōu)點和局限性。核酸內(nèi)切酶消化的方法快速并且容易，但是難以精確的控制片段長度的分布。另外這種方法可能會對基因組DNA的呈遞引入偏倚。另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA的雙鏈打斷，這種斷裂是隨機的，因此能在文庫中對DNA進行無偏的

7、呈遞。可以使用瓊脂糖凝膠電泳或者自動化的DNA分析方法，對DNA片段的尺寸分布進行控制。片段化DNA之后，需要將DNA修復(fù)，產(chǎn)生5’磷酸化的平末端DNA，以便能夠和測序平臺特異性的適配子相連接。文庫構(gòu)建的效率直接依賴于DNA末端修復(fù)的效率和準確性。末端修復(fù)混合溶液將5’或者3’的粘性末端轉(zhuǎn)變成5’磷酸化的平末端DNA。在大多數(shù)情況下，末端修復(fù)通過T4DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完成。而T4多聚核苷酸激酶

8、確保平末端的DNA片段5’端的磷酸化，以便進行后續(xù)的適配子連接。根據(jù)所使用的測序平臺，平末端DNA片段可以直接與適配子連接，或者需要在其片段的3’端增加一個單獨的突出的腺苷酸A，以便與平臺特異性適配子上突出的胸苷酸T相互配對。通常情況下，使用Klenow片段（具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步驟。T4DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫片段修復(fù)過的末端相連，然后使用回收反應(yīng)或者根據(jù)DN

9、A的尺寸，選擇性去除文庫中未連接的適配子和適配子二聚體。大小篩選方法包括使用瓊脂糖凝膠電泳分離，使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法。在連接過程中可能出現(xiàn)適配子的二聚體，它們會和與適配子連接的文庫片段共同擴增，從而降低測序平臺對真正文庫片段測序的能力并且降低測序的質(zhì)量，因此在測序之前，必須將它們從文庫中除去。一些測序平臺要求文庫片段的長度分布在比較窄的范圍內(nèi)，以得到最佳的結(jié)果，很多時候，這只能通過去除凝膠電泳上的相應(yīng)的片段條帶實現(xiàn)。這

10、種方法也可以用來去除適配子二聚體。完成這一步驟之后，應(yīng)該對DNA片段文庫的質(zhì)量進行檢測，并進行定量檢測。根據(jù)濃度和測序文庫的適配子設(shè)計，既可以直接稀釋溶液并用于測序，也可以對文庫進行選擇性擴增。在文庫擴增階段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的適配子序列，通過與PCR引物的重疊，用于后續(xù)的克隆擴增和與測序引物結(jié)合，或者提高DNA文庫的產(chǎn)量。為了得到最佳的文庫擴增結(jié)果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。文庫質(zhì)量評估方法，參見