二代基因測序技術在兒童遺傳性難治性溶血性貧血中的應用研究.pdf

1、研究目的:通過對38例溶血性貧血(Hemolytic Anemia，HA)患兒進行病因學分析，研究兒童HA的病因及發(fā)病機制，為難治性溶血性貧血病因診斷、疾病治療及預后指導提供理論依據。并通過對特殊病例的進一步分析，為建立切實有效的遺傳性難治性溶血性貧血的診斷方法提供依據，為遺傳性難治性溶血性貧血的病因診斷提供優(yōu)化途徑。
　　研究方法:對2016年1月至2016年12月長海醫(yī)院住院的38例HA患兒進行詳細的病史采集及體格檢查，并通過

2、常規(guī)檢查、抗人球蛋白試驗（Coomb's試驗）、骨髓穿刺術等相關實驗室檢查，初步對HA患兒病因進行診斷。對常規(guī)檢查手段不能明確病因的患兒，行溶血疾病檢查對紅細胞膜、酶學及血紅蛋白進行檢測，如仍病因不明或臨床反復發(fā)作的患兒，采用二代基因測序技術對其中15例患兒271個已知貧血相關基因及位點進行測序，并對測序數據進行核苷酸插入或缺失(insertionand deletion，InDel)分析和單核苷酸多態(tài)性(single nucleoti

3、de polymorphisms，SNP)分析，對篩選出的所有的與疾病相關的SNPs、lnDels使用Sanger一代測序技術進行重復驗證。同時，為了研究患兒突變基因來源和遺傳學機制，對部分貧血患兒針對該病進行家系突變基因序列分析。
　　研究結果:通過對38例HA患兒進行病因學分析及常規(guī)檢查、溶血疾病檢查發(fā)現，38例患兒中，由感染因素誘發(fā)溶血的患兒18例(18/38，47.4％，包括EB病毒感染2例，肺炎支原體感染2例)，自身免疫

4、性溶血性貧血(AIHA)患兒11例(11/38，28.9％)，紅細胞膜病6例(6/38,)，酶學異常1例(1/38，2.6％)，血紅蛋白病2例(2/38，5.3％％)。對15例通過常規(guī)檢查手段病因不明的遺傳性難治性溶血性貧血患兒采用二代測序技術對其271個已知貧血相關基進行深度測序，發(fā)現11例患兒存在致病性單基因或多基因突變，突變位點包括12個錯義突變，3個移碼突變，1個無義突變，陽性檢出率達73％;其中13個基因突變位點是國內外文獻未

5、報道的新發(fā)突變位點，并且所有的突變位點都導致了保守的氨基酸殘基及序列發(fā)生改變。采用MaxEntSca0分析算法和程序，經Provean、SIFT、Polyphen2、Mutationtaster軟件預測基因突變的潛在致病風險。
　　結論:對遺傳性難治性溶血性貧血患兒基因檢測結果顯示，單基因位點及復合位點基因突變是兒童遺傳性難治性溶血性貧血的常見病因。同時，二代基因測序技術作為遺傳性難治性溶血性貧血的一種具有高效性且特異性高的檢查手