蛋白電泳在腎臟疾病診斷中的臨床應(yīng)用

1、蛋白電泳在腎臟疾病中的臨床應(yīng)用,主講人：喬玉龍 2014年7月21日,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,1,第一部分-為什么要做尿蛋白電泳？第二部分-多發(fā)性骨髓瘤腎臟損傷?第三部分-能診斷哪些腎臟疾病?第四部分-臨床符合率怎樣？如何看電泳結(jié)果？,2,內(nèi)容提綱,腎臟病基本診斷思路,第一步：是不是腎臟??？第二步：是腎小球疾病,還是腎小管疾病？ 有條件的要確定病理類型第三步：是哪種綜合征？第四步：是何種原

2、發(fā)性疾病，腎功能是否正常？,第一步：如何判斷是不是腎臟病 ？,1.血尿、水腫、腰痛、多尿、尿頻等是腎臟疾病常見的癥狀。但上述癥狀并不能說明腎臟有病。2.以上臨床癥狀+尿常規(guī)異常（蛋白尿、血尿、管型尿,白細(xì)胞尿)3.以上臨床癥狀+腎功能異常。 以上2、3中任何一項(xiàng)才能考慮為腎臟病。,腎小球疾病,原發(fā)性腎小球疾病1.急性腎炎2.慢性腎炎3.IgA腎病繼發(fā)性腎小球疾病1.腎病綜合癥2.糖尿病腎病3.狼倉性腎炎4.

3、腎小球沉積病1）淀粉樣變性 2）輕鏈沉積病3) 巨球蛋白血癥4）冷球蛋白血癥腫瘤相關(guān)性腎小球疾病,間質(zhì)性腎炎-TIN,原發(fā)性間質(zhì)性腎炎：腎臟損傷主要位于腎小管和間質(zhì)，無明顯的腎小球和腎血管系統(tǒng)病變繼發(fā)性間質(zhì)性腎炎：腎小球和和腎血管系統(tǒng)疾病引起的小管和間質(zhì)損傷TIN是引起腎功能衰竭的重要疾病臨床表現(xiàn)：急性TIN：表現(xiàn)為少尿性或非少尿性急性腎損傷，通常腎小管會(huì)損傷。特發(fā)性急性TIN：多見于青年女性，臨床表現(xiàn)為疲乏，發(fā)

4、熱，肌肉疼痛或眼部葡萄炎等。伴有腎小管損傷征象。實(shí)驗(yàn)室檢查可有貧血，嗜酸細(xì)胞增多，血沉快，CRP及Y球蛋白升高。,腎性糖尿病腎性氨基酸尿腎小管性酸中毒范科尼綜合癥,腎小管疾病,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,7,尿,尿,量,質(zhì),尿 閉 ﹙ ≈0 ml∕day﹚無 尿 ﹙ 2500 ml∕day﹚,有形成份﹙細(xì)胞、管型、結(jié)晶﹚無形成份,,蛋白尿尿 糖尿中肌酐、尿素氮、尿酸等,尿的測定,早期腎病診斷大多依靠尿蛋白含量

5、做出大概的分類.隨著腎小球基底膜損害不斷加重,尿中排泄的蛋白量不斷增加,然而終末期腎衰患者腎小球多數(shù)已毀壞,尿量反而減少,說明尿蛋白含量的多少不一定能完全反映腎臟損傷的程度.☆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿蛋白含量與腎臟損傷程度并不呈正比.常規(guī)尿蛋白定量嚴(yán)重低估了腎臟損傷的程度,并且無法明確鑒別腎臟損傷部位.尿蛋白電泳作為腎臟疾病的早期診斷方法越來越受到重視.其有助于確定尿蛋白來源,對尿蛋白組分進(jìn)行精確分析,有助于疾病的診斷和預(yù)后的判斷,為臨床提供

6、極有價(jià)值的證據(jù).,蛋白尿,9,10-40%的MM確診時(shí) 已出現(xiàn)腎損害25%-50%的MM在病程中出現(xiàn)程度不同的腎功能異常腎損害類型管型腎病-骨髓瘤腎?。–N）-最常見（腎小管損害）淀粉樣變性免疫球蛋白沉積?。∕IDD）,骨髓瘤腎臟損害,10,腎臟疾病的病因機(jī)制,腎功能衰竭,穿刺部位,腎穿禁忌癥,出凝血異常孤立腎一般情況差小腎其他過度肥胖、重度腹水、配合欠佳,合并癥及其處理,出血大出血血腫血尿感染動(dòng)靜瘺上

7、海新華醫(yī)院 – 中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)副主席-沈霞教授總結(jié): 腎活檢雖然對腎臟疾病的病理及免疫分型具有很高的診斷性,但由于腎穿刺屬于創(chuàng)傷性診斷技術(shù),可能造成出血,感染等并發(fā)癥,而且穿刺技術(shù)及取材部位也會(huì)影響穿刺的成敗,因此患者對此顧慮較大.,合并癥及其處理,出血大出血血腫血尿感染動(dòng)靜瘺上海新華醫(yī)院 – 中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)副主席-沈霞教授總結(jié): 腎活檢雖然對腎臟疾病的病理及免疫分型具有很高的診斷性,但由于腎穿刺屬于創(chuàng)傷性診斷技

8、術(shù),可能造成出血,感染等并發(fā)癥,而且穿刺技術(shù)及取材部位也會(huì)影響穿刺的成敗,因此患者對此顧慮較大.,解放軍總醫(yī)院-腎內(nèi)科-陳香美院士,迄今為止，各類腎病的臨床診斷與病情的進(jìn)展判斷主要依賴于腎活檢，其次為尿蛋白，血液生化等檢測指標(biāo)。腎活檢的創(chuàng)傷性使其難以隨時(shí)施行，而臨床的血液生化指標(biāo)又難以早期，全面地反映疾病的病理改變。因此，國外及國內(nèi)多數(shù)專家學(xué)者，試圖通過蛋白組學(xué)研究方法找到與腎臟疾病相關(guān)的特殊蛋白質(zhì)標(biāo)志物，以用于早期診斷與療效的隨訪

9、觀察。蛋白電泳是尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分離和鑒定的常用方法。 摘自: 單位：北京解放軍301醫(yī)院-腎內(nèi)科-陳香美院士,,17,腎小球損傷的-尿蛋白譜,腎小球性腎炎病理因素(感染)糖尿病腎病自身免疫性疾病腫瘤,與腎小球蛋白尿相關(guān)的疾病,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,18,19,20,腎盂腎炎腎血管性疾病遺傳病:范科尼綜合癥腎毒性物質(zhì):重金屬(鉛,鈣)藥物性腎病:抗癌藥,慶大霉素等,與腎小管蛋白尿相關(guān)的疾病,北京康圣安科

10、技發(fā)展有限公司,21,22,23,a2-巨球蛋白 (900 kDa),,,,,SDS,,SDS,,+,,-,,,分子篩,原理：分子量排列,SDS：十二烷基磺酸鈉,25,SDS 尿蛋白 圖譜,電泳技術(shù)由于操作方便, 成本低廉, 目前已成為許多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體液(血清, 尿液, 腦脊液…)分離、分析的常規(guī)方法之一 蛋白電泳是一項(xiàng)用途廣泛的檢測技術(shù), 可用于多種疾病的檢測 (肝硬化, 腎病綜合癥, 多發(fā)性硬化癥, 血紅蛋白病, 單克隆免

11、疫球蛋白疾病…） 目前, 尚沒有一種方法可以取代電泳技術(shù)用于檢測多發(fā)性骨髓瘤中出現(xiàn)的單克隆免疫球蛋白(M蛋白) 電泳結(jié)果中對電泳圖譜的分析很重要，是唯一具有病理診斷價(jià)值的檢驗(yàn)項(xiàng)目。,第二部分. 為什么會(huì)誤診與漏診？如何避免？,2.多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma MM),河北省第三人民醫(yī)院 1557例

12、多發(fā)性骨髓瘤誤診分析,呂鴻雁, 張金巧. 河北醫(yī)藥. 2009, 31(9): 1052-54,誤診率：65.17%,重視實(shí)驗(yàn)診斷,39.8%,15.6%,19.8%,7.6%,15.6%,就診晚 2/3 確診時(shí)已達(dá)中晚期 誤診率高 1/3 非血液科首診 >60%,多發(fā)性骨髓瘤診治現(xiàn)狀,晚骨折預(yù)后差增加負(fù)擔(dān)感染發(fā)生率高腎臟病變不可逆,,死亡率 ↑↑,華西醫(yī)院對-多發(fā)性骨髓瘤的誤診原因分析,MM缺乏特異性,首發(fā)癥狀

13、多種多樣。骨痛常為早期癥狀,骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)破壞后,極易造成病理性骨折,誤診為骨科疾病☆發(fā)現(xiàn)尿蛋白或尿素氮升高,而被誤診為腎臟疾病因面色蒼白、乏力、納差、頭暈等貧血癥狀常被誤診為貧血;,診治現(xiàn)狀分析：北大人民醫(yī)院 - 血液病研究所 -黃曉軍（全國主任委員）,診斷及預(yù)后評估體系欠廣泛應(yīng)用是影響MM規(guī)范化治療的原因之一。規(guī)范化治療源于正確的診斷。MM的診斷必須進(jìn)行血和尿的免疫固定電泳以及24小時(shí)尿的蛋白電泳檢測。目前仍有很

14、多單位無法進(jìn)行免疫固定電泳檢測，以北京25家三級甲等醫(yī)院調(diào)查為例：14家醫(yī)院不能進(jìn)行免疫固定電泳檢測，基本上所有醫(yī)院均不常規(guī)進(jìn)行尿蛋白電泳的檢測。摘自-《中華血液學(xué)雜志2013年4月第34卷第4期》,sebia,31,診治現(xiàn)狀分析：天津血液病研究所-邱錄貴,漏診與誤診原因分析1.目前初次就診的MM患者漏診和誤診率仍然很高，主要原因是：非血液科醫(yī)師：對本病缺乏認(rèn)識 血液科醫(yī)師： 對診斷標(biāo)準(zhǔn)掌握不準(zhǔn)2.骨髓穿刺的局限性

15、由于MM細(xì)胞在骨髓內(nèi)分布不均，可能會(huì)導(dǎo)致某些部位的骨髓穿刺結(jié)果低于上述數(shù)值，使得部分患者漏診MM早期瘤細(xì)胞散在分布于造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間，骨髓穿不易抽取到瘤細(xì)胞。瘤細(xì)胞分泌M蛋白，具有較正常有核細(xì)胞更強(qiáng)的骨髓基質(zhì)粘附性，細(xì)胞越幼稚，粘附力越強(qiáng)，容易出現(xiàn)空抽。(華西醫(yī)院-血液科）3.現(xiàn)有參考標(biāo)準(zhǔn)過時(shí)舊的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2003年前）不利于寡分泌型和不分泌型MM的診斷國內(nèi)目前多數(shù)教科書及血液科醫(yī)師廣泛參考的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第

16、3版）MM的診斷仍然沿用以往的診斷標(biāo)準(zhǔn)，需要及時(shí)更新。摘自-《中華血液學(xué)雜志2013年4月第34卷第4期》,32,多發(fā)性骨髓瘤分型,,,多發(fā)性骨髓瘤分型,單克隆（10種）Ig G,IgA, Ig M,IgD, Ig E, (kappa，lambda),輕鏈型（2種） kappa，lambda,雙克隆型,不分泌型,14種,多發(fā)性骨髓瘤臨床表現(xiàn)/并發(fā)癥,,Calcium,Renal,Anemia,Bone,CRAB,起因：主要與

17、單克隆輕鏈造成的腎臟損害有關(guān)，病理學(xué)上可以表現(xiàn)為3種：管型腎病-骨髓瘤腎病淀粉樣變性輕鏈沉積病或混合型血清肌酐及GFR-主要針對腎小球 不同類型的M蛋白造成腎功能損害的概率不同IgG骨髓瘤-本周陽性率 60%IgA骨髓瘤-本周陽性率 71%IgD骨髓瘤-本周陽性率 100%,多發(fā)性骨髓瘤-腎功能不全,36,,,多發(fā)性骨髓瘤最新診治指南-診斷部分解讀 （2013版）

18、 上海長征醫(yī)院-侯健,2013診治指南-診斷部分更新內(nèi)容注重概念的深化強(qiáng)調(diào)骨髓瘤的診斷要認(rèn)識疾病的本質(zhì)，即導(dǎo)致相關(guān)靶器官的損害，出現(xiàn)典型的CRAB癥狀及免疫力低下所導(dǎo)致的反復(fù)感染，高滯血癥等。同時(shí)又要重視瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征及對療效和預(yù)后的影響。注重把握新的診斷技術(shù)的應(yīng)用首次列入并明晰了診斷骨髓瘤的必須檢測項(xiàng)目及對診斷或判斷預(yù)后有價(jià)值的項(xiàng)目，必須檢測項(xiàng)目是診斷骨髓瘤最為基

19、本而不可或缺的內(nèi)容。注重把握新標(biāo)準(zhǔn)的界定：在診斷標(biāo)準(zhǔn)上提出了新的診斷定義：在有癥狀骨髓瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)中不再強(qiáng)調(diào)M蛋白的數(shù)值，只要有血清和（或）尿中出現(xiàn)單克隆M蛋白，即為標(biāo)準(zhǔn)之一，但仍要求骨髓單克隆漿細(xì)胞比列≥10%。少數(shù)小于10%，若能證實(shí)CRAB癥狀由克隆性漿細(xì)胞引起，也可診斷。摘自《中華內(nèi)科雜志-2013年9月第52卷第9期》,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,38,《2013版-多發(fā)性骨髓瘤診療指南》

20、 多發(fā)性骨髓瘤必需檢測項(xiàng)目,多發(fā)性骨髓瘤-國際診斷標(biāo)準(zhǔn)流程,,,,,第三部分-能診斷哪些腎臟疾病?,1.血清蛋白電泳2.血-免疫固定電泳3.尿-免疫固定電泳4.尿蛋白電泳,1.確定尿蛋白類型(見59-61頁幻燈）2.早期糖尿病腎病的診斷早期表現(xiàn):微量尿蛋白陽性糖尿病腎病電泳圖譜特征:以大分子蛋白為主, 腎損傷以腎小球?yàn)橹?腎小管損傷較輕. 3.早期高血壓腎病的診斷電泳圖

21、譜特征:以小分子蛋白如a1-微球蛋白為主，腎損傷以腎小管為主，腎小球損傷較輕尿蛋白以腎小管性，混合型蛋白尿?yàn)橹?，對腎臟損傷較重,臨床應(yīng)用范圍-北京天壇醫(yī)院-康熙雄教授,42,4.慢性腎炎，腎病 慢性腎炎，腎病為混合型蛋白尿，以腎小球性蛋白尿?yàn)橹鳎裟I小管性蛋白尿增多時(shí)，表明預(yù)后不良。 5.腎功能不全尿中檢出的腎小管蛋白種類越多，腎功能惡化程度越嚴(yán)重.腎小管間質(zhì)損害對腎小球腎炎患者的預(yù)后有著重要的影響。慢性腎功能不全患

22、者中，腎小球腎炎引起的最為常見,約占50%-60%，發(fā)展到腎功能不全時(shí)，尿蛋白電泳結(jié)果為混合性蛋白尿，各小管蛋白種類也增多，約在3種左右。6.尿免疫固定-尿游離輕鏈-多發(fā)性骨髓瘤,臨床診斷疾病,43,濾紙電泳醋酸纖維素薄膜電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳—臨床聚丙烯酰胺凝膠電泳—科研毛細(xì)管電泳電泳技術(shù)的革命,蛋白電泳技術(shù)的變遷,電泳技術(shù)的原理,-,+,蛋白加樣位置,陰極,陽極,0,+,,正常血清,單克隆 Ig,1.血清蛋白電泳,

23、血清蛋白電泳是檢測M蛋白的唯一方法,若在?區(qū)出現(xiàn)異常的峰，且高寬比大于2:1,可以初步判定為M蛋白峰,正常血清蛋白電泳圖譜,血清蛋白電泳：M蛋白形成異常濃集帶，位于γ 區(qū)內(nèi)，或β 、α2 區(qū)內(nèi)可見一窄底的高峰。由于尿液可以濃縮許多倍，因此檢查游離輕鏈時(shí)尿蛋白電泳（UPEP）比SPEP靈敏。80%的MM患者可發(fā)現(xiàn)M蛋白,,,,血M蛋白鑒定,急性腎炎,特征：以急性腎炎綜合征為主要臨床表現(xiàn)的腎臟疾病：血尿，蛋白尿，水腫，高血壓臨床表現(xiàn)：本

24、病主要發(fā)生于兒童，高峰年齡為2-6歲，2歲以下或40歲以上的患者僅占所有患者15%。病理檢查：病理免疫熒光檢查可見：免疫復(fù)合物沉積，主要是IgG和C3，IgA和IgM較少見電鏡檢查可見上皮細(xì)胞下“駝峰狀”電子致密物沉積。,實(shí)驗(yàn)室檢查,尿液檢查：幾乎所有患者都有鏡下血尿或肉眼血尿。尿中紅細(xì)胞多為畸形紅細(xì)胞。尿沉渣可見白細(xì)胞，小管上皮細(xì)胞，并可有紅細(xì)胞管型，顆粒管型。血常規(guī)：可由輕度貧血，白細(xì)胞計(jì)數(shù)可正常或升高，血沉加快。免疫學(xué)檢

25、查： 動(dòng)態(tài)觀察C3的變化對診斷急性腎炎非常重要。疾病早期，C3下降，8周內(nèi)恢復(fù)到正常水平，是急性腎炎的重要特征。,電泳圖譜---急性炎癥,P N,,,,慢性腎炎,臨床表現(xiàn)：以血尿，蛋白尿，水腫和高血壓為基本癥狀。發(fā)病機(jī)制：主要與原發(fā)病的免疫炎癥損傷有關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查：疾病早期尿液檢查可表現(xiàn)為程度不等的蛋白尿或血尿，可見紅細(xì)胞管型，部分患者出現(xiàn)大量蛋白尿，定量結(jié)果大于3.5g/24h.,電泳圖譜---慢性炎癥,,,

26、①高蛋白尿 ②高度水腫 ③高脂血癥 ④低白蛋白血癥,,三高一低,腎病綜合征是腎小球疾病中一種常見的臨床綜合征,,微小病變性腎病系膜增生性腎小球腎炎局灶節(jié)段性腎小球硬化癥膜　性　腎　病膜增生性腎小球腎炎,,,原發(fā)性,,系統(tǒng)性紅斑狼瘡 糖尿病過敏性紫癜乙型肝炎多發(fā)性骨髓瘤,原發(fā)性,繼發(fā)性,,膽固醇三酰甘油,總蛋白白蛋白< 30g/L,尿液檢查,血液學(xué)檢查,,,,白蛋白α1、?球蛋白α2、?球蛋白,

27、,,血脂,血漿蛋白電泳,血漿蛋白,,,,,,,,,,N P,總蛋白濃度降低(低于 60g/l),,電泳圖譜---腎病綜合征,,,,,M蛋白？什么類型？,2. 血清免疫固定電泳,G A M kappa lambda,血清免疫固定電泳,ELP 泳道: 固定液G 泳道： 抗 IgG 重鏈抗血清A 泳道： 抗 IgA 重鏈抗血清M 泳道： 抗 IgM 重鏈抗血清K 泳道： 抗? 輕鏈抗血清L 泳道：

28、 抗 ?輕鏈抗血清,儀器： Sebia 瓊脂糖凝膠電泳儀 試劑：免疫固定電泳試劑靈敏度：31-125ug/L,正常血清免疫固定,確認(rèn)IgM ?型M蛋白,血清蛋白免疫固定電泳應(yīng)用舉例 （1）,,IF,在?區(qū) 發(fā)現(xiàn)疑似M蛋白,,輕鏈病,血清蛋白免疫固定電泳特殊病例,免疫固定結(jié)果顯示為單獨(dú)的 l 成分,本周氏蛋白,1844年Henry Bence Jones 在一個(gè)骨髓瘤患者尿中發(fā)現(xiàn)一種具有特殊凝溶性質(zhì)的蛋白40－60℃發(fā)生沉淀，加

29、熱煮沸時(shí)溶解，冷卻后又沉淀輕鏈二聚體大多數(shù)骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白,漿細(xì)胞病的診斷和治療監(jiān)測某些情況下，特別是對輕鏈型的M蛋白，比血清免疫固定電泳更加敏感因?yàn)橛坞x輕鏈的分子量比較?。?5－50KDa）更容易通過腎臟清除進(jìn)入尿液中，從而在尿中被檢測到,本周氏蛋白電泳的臨床意義,90~100℃,40~60℃,室溫,本周氏蛋白檢測方法—熱沉淀反應(yīng)法,本周氏蛋白檢測方法---尿液的免疫固定電泳,,,重鏈,參考泳道,復(fù)合輕鏈,游離

30、輕鏈,4.尿蛋白電泳,68,,,,,,白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫球蛋白小分子蛋白,,小分子蛋白,微量免疫球蛋白， 轉(zhuǎn)鐵蛋白，白蛋白,腎小球?yàn)V過,白蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫球蛋白小分子蛋白,,,,,,小分子蛋白,腎小管重吸收,,,,,,,微量免疫球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，白蛋白,尿液,SDS尿蛋白電泳圖譜,,,,,SDS,,SDS,,+,,-,,,,分子量標(biāo)記 (kDa),14.4,30,43,67,94,,,,,,,,,,,低分子量 (&l

31、t; 67 kDa),高分子量(> 67 kDa),白蛋白( 67 kDa),分子篩,腎小球性蛋白尿,,,,,,< 67 kDa,白蛋白,> 67 kDa,腎小管性蛋白尿,,混合性蛋白尿,> 67 kDa,< 67 kDa,,,,,,,,,SDS尿蛋白電泳,,15號樣本BJ電泳,尿蛋白電泳的聯(lián)合應(yīng)用,尿本周氏蛋白電泳,,游離kappa,敏感性高：檢測限為15mg/L標(biāo)本收集：隨機(jī)尿，無需濃縮(推薦晨尿

32、)檢測結(jié)果尿蛋白的全貌直觀反映腎臟受損部位對不愿意進(jìn)行腎穿檢查的病人,可作為替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)觀察：對確診或不典型患者可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,SDS非濃縮尿蛋白電泳檢測的優(yōu)勢,第四部分-給臨床的報(bào)告單格式,報(bào)告單必須含有以下內(nèi)容: 電泳條帶圖譜 檢測結(jié)果的M蛋白峰必須給出%和g/L數(shù)值 全部圖譜條帶的解析,77,尿蛋白電泳報(bào)告單,,電泳標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告單,,,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,78,,Thanks,喬玉龍電話：156037