抗多囊蛋白-1單克隆抗體和多克隆抗體的制備及其在常染色體顯性遺傳性多囊腎病發(fā)病機(jī)理研究中的應(yīng)用.pdf

1、探討體液中多囊蛋白-1的定量檢測在臨床ADPKD診治中的應(yīng)用價值.該研究由三部分組成.一、多囊蛋白-1胞外區(qū)的重組表達(dá)及純化.提取健康人腎組織總RNA，根據(jù)已知的PKD1cDNA序列（GenBankL33243），自行設(shè)計2對引物跨越多囊蛋白-1成熟蛋白的氨基端部分LRR區(qū)和部分WSC區(qū).用一步法RT-PCR選擇擴(kuò)增編碼多囊蛋白-1這一多拷貝區(qū)的兩個cDNA片段（其大小分別為502bp和471bp），并將之克隆到融合蛋白表達(dá)載體pQE3

2、0中，構(gòu)建的表達(dá)載體pQE30-PKD1e1和pQE30-PKD1e2，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序證實為所需要的質(zhì)粒后，將其轉(zhuǎn)染含有阻遏質(zhì)粒pREP4的大腸桿菌M15.異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)氨基端有6個連續(xù)組氨酸的融合蛋白，用Ni-NTA Agarose行親和層析純化融合蛋白.純化產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示出相對分子質(zhì)量分別為19.8kD、18.9kD的融合蛋白，經(jīng)Western blot鑒定為

3、多囊蛋白-1的融合蛋白.這2段多囊蛋白-1氨基端的融合蛋白都可用于免疫動物，制備抗多囊蛋白-1氨基端的融合蛋白都可用于免疫動物，制備抗多囊蛋白-1胞外區(qū)氨基端的抗體.二、抗多囊蛋白-1單克隆抗體和多克隆抗體的制備.將純化好的分子量18.9kD的多囊蛋白-1的融合蛋白皮下免疫Balb/C小鼠和新西蘭大白兔，分別制備抗多囊蛋白-1的單克隆抗體和多克隆抗體.三、多囊蛋白-1的組織細(xì)胞學(xué)定位和體液中多囊蛋白-1胞外段的定量檢測.1.多囊蛋白-1

4、在腎組織和細(xì)胞中的表達(dá)研究.2.體液中多囊蛋白-1胞外段的定量檢測.Qian等人最近提出多囊蛋白-1在G蛋白偶聯(lián)受體的蛋白分解位點（多囊蛋白-1的GPS區(qū)）發(fā)生剪切，GPS區(qū)的蛋白分解剪切功能可能與多囊蛋白-1在腎臟中的正常功能有關(guān).按照這種理論，多囊蛋白-1雖不是分泌蛋白，但在體液中應(yīng)該能檢測到多囊蛋白-1的胞外區(qū)部分，而且正常人體液中的多囊蛋白-1含量將高于ADPKD病人.由于體液中多囊蛋白-1的含量在ADPKD病人和正常人之間有顯