sFRP4在常染色體顯性遺傳性多囊腎中介導(dǎo)Wnt-β-catenin信號(hào)通路和PI3K-AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡的作用.pdf

1、目的：研究分泌型卷曲相關(guān)蛋白4（sFRP4）在常染色體顯性遺傳性多囊腎?。ˋDPKD）中的表達(dá)及其引發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法：1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：（1）血標(biāo)本實(shí)驗(yàn)：收集12例正常人和20例已確診ADPKD患者的血漿，ELISA法檢測(cè)血漿sFRP4的水平。（2）組織學(xué)實(shí)驗(yàn)：取對(duì)照腎組織和ADPKD腎組織各3例。免疫組織化學(xué)法觀察sFRP4在腎臟中的表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)腎組織中細(xì)胞凋亡；RT-PCR法檢測(cè)人腎組織中 sFRP4 mRN

2、A、caspase-3 mRNA、GSK3βmRNA、β-catenin mRNA、cyclind1 mRNA水平；Western blot法檢測(cè)腎組織中sFRP4、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、cyclind1、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平。（3）斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)：斑馬魚(yú)受精卵內(nèi)顯微注射200pg sFRP4 mRNA，55h后光鏡下

3、觀察sFRP4過(guò)表達(dá)后斑馬魚(yú)原腎囊腫形成情況。2.體外實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)）：HEK-293T細(xì)胞分為正常對(duì)照組、PcDNA6對(duì)照組和sFRP4組，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測(cè)cleaved-caspase-3、pro-caspase-3蛋白表達(dá)情況。HEK-293T細(xì)胞分為對(duì)照組、Wnt3α組和Wnt3α+sFRP4共轉(zhuǎn)染組，Western blot法檢測(cè)β-catenin、p-AKT、AKT、NF-κB、

4、Bax、cleaved-caspase9、pro-caspase9蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.ADPKD患者血漿中sFRP4水平顯著高于健康人。2.相比對(duì)照組，免疫組化法觀察到sFRP4在ADPKD患者腎小管上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)明顯升高。3.TUNEL法檢測(cè)結(jié)果示腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加。4.ADPKD腎組織中sFRP4、caspase-3、β-catenin、cyclind1 mRNA水平均高于對(duì)照組，而GSK3βmRNA水平下降

5、。Western blot結(jié)果表明 sFRP4、cleaved-caspase-3、p-GSK3β、β-catenin、cyclind1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，而GSK3β、p-β-catenin、p-AKT/AKT低于對(duì)照組。5.斑馬魚(yú)受精卵內(nèi)注射sFRP4 mRNA后可見(jiàn)原腎囊腫形成。6.HEK-293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)sFRP4，可致細(xì)胞凋亡率增加，凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-caspase9、cleaved-caspase-3表達(dá)