雷帕霉素通過抑制mTOR-ULK1通路上調(diào)自噬反應減輕足細胞損傷.pdf

1、背景與目的：足細胞損傷與丟失是腎小球疾病進展的重要原因，作為有絲分裂后細胞重要保護機制的自噬反應對足細胞至關(guān)重要。在正常腎臟中足細胞的自噬水平明顯高于其他細胞，提示自噬可能在維持足細胞穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。有研究指出正常情況下足細胞內(nèi)存在低mTOR高自噬的mTOR-autophagy平衡，故而mTOR-autophagy平衡改變對足細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)存在影響，其具體機制還不明確。本文旨在通過被動型海曼腎炎大鼠模型以及嘌呤霉素氨基核昔酸培養(yǎng)

2、的足細胞探求mTOR-自噬活性改變與足細胞損傷的具體機制。
　　 方法：采用3月齡SD雄性大鼠建立足細胞損傷的被動型海曼腎炎模型，在模型建立的1d、7d、14d、21d及28d處死大鼠，留取腎皮質(zhì)，處死前留取24h尿樣。體外用嘌呤霉素氨基核苷酸(puromycin aminonucleoside，PAN)處理小鼠足細胞條件永生系(Mouse Podocyte cell5，MPC5)，模擬體內(nèi)足細胞損傷建立體外足細胞損傷模型，模型

3、建立成功后用雷帕霉素(rapamycin)處理細胞或轉(zhuǎn)染siRNA。利用western blot及免疫熒光染色技術(shù)對模型大鼠腎皮質(zhì)及處理過的足細胞進行分析。
　　 結(jié)果：與對照組大鼠相比，模型大鼠在7d時出現(xiàn)明顯蛋白尿，足細胞骨架相關(guān)蛋白synaptopodin表達下調(diào)，自噬水平較低，此時mTOR信號通路激活，其相關(guān)蛋白p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1表達水平明顯上調(diào)，提示mTOR信號通路的激活與足細胞損傷有關(guān)。1

4、4d時mTOR信號通路依然處于活化狀態(tài)，足細胞損傷至最重，此時自噬水平明顯上調(diào)。21d時mTOR信號通路明顯弱化，而自噬水平依然較高，足細胞損傷減輕，可見自噬反應的上調(diào)可以保護受損的足細胞，減輕足細胞損傷。體外實驗中，足細胞損傷時mTOR信號通路活化，自噬起始關(guān)鍵蛋白ULK1磷酸化水平上調(diào)，自噬受抑制。用rapamycin處理細胞后，發(fā)現(xiàn)自噬水平上調(diào)，p-ULK1水平下調(diào)，足細胞損傷明顯好轉(zhuǎn)，rapamycin能夠通過抑制mTOR-UL

5、K1通路減輕足細胞損傷。利用siRNA干擾自噬反應后，即使采用rapamycin處理足細胞損傷并沒有減輕，表明白噬對足細胞有保護作用，它能夠幫助足細胞從損傷中恢復。
　　 結(jié)論：在體內(nèi)與體外實驗中我們均發(fā)現(xiàn)了足細胞損傷與自噬水平的改變有關(guān)，損傷發(fā)生時mTOR通路的活化可能是自噬水平下調(diào)及足細胞損傷的重要原因。Rapamycin能夠通過抑制mTOR上調(diào)自噬水平減輕足細胞損傷，上調(diào)的自噬水平能夠保護受損的足細胞，幫助其從損傷中恢復。