利拉魯肽通過(guò)AMPK信號(hào)通路促進(jìn)自噬流減輕ZDF大鼠心肌損傷.pdf

1、研究背景:
　　糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死亡原因之一，并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。糖尿病性心肌病是糖尿病心血管并發(fā)癥中的重要一員，它指的是發(fā)生于糖尿病患者（包括1、2型），不可以用冠心病、高血壓性心肌病等其他原因解釋的心肌疾病。糖尿病性心肌病的診斷目前尚無(wú)一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。其特點(diǎn)是心肌結(jié)構(gòu)和功能異常，例如左心室舒張和收縮功能障礙和心肌顯著的間質(zhì)纖維化。糖尿病性心肌病進(jìn)一步進(jìn)展可導(dǎo)致患者心力衰竭和心律失常等，重癥者甚至死亡。及時(shí)

2、有效地治療糖尿病性心肌病對(duì)降低糖尿病患者的死亡率有著積極的意義。然而，目前臨床上并沒(méi)有可以有效地治療糖尿病性心肌病的藥物。
　　利拉魯肽是一種人胰高血糖素樣肽-1類(lèi)似物，現(xiàn)已在臨床上用于治療2型糖尿病。臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明，人胰高血糖素樣肽-1類(lèi)似物具有心血管保護(hù)作用，例如改善冠狀動(dòng)脈缺血患者的心肌功能以及減緩動(dòng)脈粥樣硬化的病變。然而，利拉魯肽對(duì)糖尿病性心肌病是否同樣具有保護(hù)作用及其潛在的作用機(jī)制尚未闡明。
　　自噬是細(xì)胞內(nèi)的

3、一種用來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的“自我消化”的途徑。自噬既可降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊或變性的蛋白質(zhì)及其聚合物，也可降解受損的線粒體等細(xì)胞器。自噬被認(rèn)為是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，被稱作為“自噬流”。有研究表明，自噬在糖尿病性心肌病的病變發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。利拉魯肽可促進(jìn)肝細(xì)胞和胰島β細(xì)胞內(nèi)的自噬水平從而增加細(xì)胞活性，但是目前尚未證實(shí)利拉魯肽可通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)的自噬流水平而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。另外，AMPK是一個(gè)經(jīng)典的自噬上游信號(hào)調(diào)節(jié)通路，AMPK信號(hào)通路受

4、到抑制可引起自噬水平的下降。有研究報(bào)道，利拉魯肽可激活骨骼肌細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)的AMPK信號(hào)通路。因此，提出假設(shè):利拉魯肽可通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬流從而減輕糖尿病性心肌損傷。
　　研究目的:
　　1.在肥胖Zucker大鼠糖尿病動(dòng)物模型及原代心肌細(xì)胞高糖模型中，證實(shí)利拉魯肽可減輕糖尿病性心肌損傷。
　　2.探究利拉魯肽對(duì)糖尿病性心肌自噬的作用及其潛在的分子作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.體

5、內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選用肥胖Zucker大鼠及其正常對(duì)照Z(yǔ)ucker大鼠（8周齡）。肥胖Zucker大鼠給予高脂飲食，正常對(duì)照Z(yǔ)ucker大鼠給予正常飲食。ZDF大鼠分組為:(1)正常對(duì)照組（Con組）;(2)糖尿病性心肌病組（DCM組）;(3)糖尿病性心肌病+利拉魯肽組（DCM+LG組）;(4)糖尿病性心肌病+氯喹組（DCM+CQ組）;(5)糖尿病性心肌病加+利拉魯肽+氯喹組（DCM+LG+CQ組）。皮下注射利拉魯肽(200μg

6、/kg)，腹腔注射氯喹(25mg/kg)，每天一次，連續(xù)注射8周。第16周，采集各組的大鼠血液樣本用于進(jìn)一步檢測(cè)大鼠的血糖、血脂、心肌酶等生化指標(biāo)。大鼠處死前一天，進(jìn)行小動(dòng)物超聲心功能檢測(cè)。將大鼠脫頸處死后，取材大鼠心肌組織進(jìn)行固定，用于后續(xù)的電鏡、免疫組織化學(xué)、Masson三色染色、蛋白免疫印跡技術(shù)(WB)檢測(cè)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　采用SD大鼠新生乳鼠（1-3天）原代心肌細(xì)胞。將原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)于一定濃度的含葡萄糖培養(yǎng)

7、液中，模擬體內(nèi)高糖狀態(tài)，建立原代心肌細(xì)胞高糖模型。細(xì)胞分組為:正常對(duì)照組（Con組）、高糖組(HG組)、高糖+利拉魯肽組(HG+LG組)、高糖+氯喹（HG+CQ組）、高糖+利拉魯肽+氯喹組（HG+LG+CQ組）、高糖+Comp C(HG+C)、高糖+利拉魯肽+Comp C(HG+LG+C)。心肌細(xì)胞在高糖環(huán)境中培養(yǎng)96小時(shí)，利拉魯肽和氯喹作用時(shí)間為24小時(shí)。每天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。采用MTS檢測(cè)心肌細(xì)胞活力;采用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

8、;采用Ad-mRFP-GFP-LC3病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè)自噬流;采用WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(LC3、p62)和AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白(AMPK、mTOR)。
　　研究結(jié)果:
　　1.利拉魯肽減輕心肌細(xì)胞損傷
　　(1)利拉魯肽降低ZDF大鼠血脂血糖水平。血生化檢測(cè)分析顯示:與DCM組相比，利拉魯肽處理組的血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL)水平是下降的。
　　(2)利拉魯肽減輕ZDF大鼠心肌損傷。ZDF大

9、鼠心臟超聲檢測(cè)結(jié)果顯示:與DCM組相比，利拉魯肽增加左室短軸縮短率(LVFS)值。血生化檢測(cè)分析顯示:在利拉魯肽組，大鼠血清肌酸激酶(CK)和血清乳酸脫氫酶(LDH)水平下降。應(yīng)用自噬抑制藥物氯喹后，大鼠血清CK和LDH水平增高。
　　(3)利拉魯肽減輕高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷。MTS檢測(cè)結(jié)果顯示:利拉魯肽增加心肌細(xì)胞在高糖狀態(tài)下的細(xì)胞活性。TUNEL檢測(cè)顯示:利拉魯肽減少糖毒性引起的心肌細(xì)胞凋亡。在上述檢測(cè)方法中，利拉魯肽的保

10、護(hù)作用可被自噬抑制藥物氯喹大部分抑制。
　　2.利拉魯肽減輕ZDF大鼠心肌纖維化。Masson三色染色法顯示:利拉魯肽組心肌的膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)小于DCM組。共同使用自噬抑制藥物氯喹后，CVF值再次增大。
　　3.利拉魯肽增加心肌細(xì)胞內(nèi)自噬水平。
　　(1)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利拉魯肽增加ZDF大鼠心肌組織的自噬表達(dá)水平。透射電鏡檢測(cè)顯示:利拉魯肽組的自噬小體的數(shù)量多于DCM組。免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示:利拉魯肽組中LC3B

11、蛋白的表達(dá)水平增加。WB檢測(cè)顯示:利拉魯肽組中LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加，p62蛋白表達(dá)下降。在上述檢測(cè)方法中，自噬抑制藥物氯喹可部分消除利拉魯肽對(duì)自噬的影響作用。
　　(2)在體外實(shí)驗(yàn)中，利拉魯肽增加高糖培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞內(nèi)自噬水平。Ad-mRFP-GFP-LC3病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè)顯示:利拉魯肽組的黃點(diǎn)（自噬體）和紅點(diǎn)數(shù)量（自噬溶酶體）均增加，尤其是黃點(diǎn)（自噬體）增加明顯。加入自噬體抑制劑3-MA后，黃點(diǎn)（自噬體）和紅點(diǎn)（自噬溶酶體）均明顯

12、減少。WB檢測(cè)顯示:利拉魯肽可增加LC3Ⅱ/Ⅰ比值。與HG+CQ組相比，HG+LG+CQ組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加。
　　4.利拉魯肽激活原代心肌細(xì)胞內(nèi)的AMPK-mTOR信號(hào)通路。WB檢測(cè)顯示:在利拉魯肽組中，p-AMPK/AMPK比值增大（AMPK磷酸化水平增高）和p-mTOR/mTOR比值減小(mTOR磷酸化水平下降)。
　　研究結(jié)論:
　　1.利拉魯肽通過(guò)增加心肌細(xì)胞內(nèi)的自噬水平減輕糖尿病性心肌損傷。