朊病毒病中AMPK-ULK1自噬調(diào)節(jié)通路的研究.pdf

1、朊病毒病，是一類可感染包括人類在內(nèi)多種哺乳動(dòng)物的致死性神經(jīng)退行性疾病，又稱可傳播性海綿狀腦病(Transmissible spongiformencephalopathies，TSEs)。具有感染性和復(fù)制能力的異常朊蛋白(Prpsc)的沉積被認(rèn)為是朊病毒病的主要致病原因，因此蛋白降解系統(tǒng)的異常改變在朊病毒病的發(fā)生、發(fā)展過程中就顯得尤為重要。
　　自噬是細(xì)胞吞噬自體胞質(zhì)、衰老細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白以及病原體，然后將其降解成氨基酸重新再

2、利用的生物過程，整個(gè)過程包括起始、延伸、成熟和降解幾個(gè)階段。自噬主要受哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin，mTOR）依賴性通路和非mTOR依賴性通路以及一些蛋白激酶的調(diào)節(jié)。單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、Unc樣激酶1(Unc-like kinase1,ULK1)是調(diào)節(jié)自噬的重要激酶，可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。有研究表明，ULK1的

3、第555位氨基酸-絲氨酸555(Ser555)是正向調(diào)節(jié)自噬的一個(gè)重要磷酸化位點(diǎn)，而抑制性位點(diǎn)Ser757受mTOR的調(diào)控，負(fù)調(diào)節(jié)自噬。本課題研究了朊病毒感染后AMPK-ULK1信號通路調(diào)節(jié)自噬的情況。
　　本研究主要從體內(nèi)和體外兩方面展開研究。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn):羊瘙癢因子263K感染的倉鼠腦組織中AMPKα1/2和172位蘇氨酸磷酸化的AMPKα(p-AMPK(Thr172))、ULK1和555位絲氨酸磷酸化的ULK1(p-ULK1

4、(Ser555))的蛋白表達(dá)水平相比正常倉鼠腦組織有顯著的升高，而757位絲氨酸磷酸化的ULK1(p-ULK1(Ser757))的表達(dá)水平卻有明顯下降。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:263K感染的倉鼠腦組織切片中小腦、皮質(zhì)、腦干部位表達(dá)AMPKα1/2、p-AMPK(Thr172)、ULK1和p-ULK1(Ser555)陽性信號的細(xì)胞都有明顯的增加;而其小腦部位表達(dá)p-ULK1(Ser757)陽性信號的細(xì)胞有明顯的減少，皮質(zhì)和腦干部位幾乎檢

5、測不到陽性細(xì)胞。263K感染的倉鼠腦組織勻漿中AMPK上游肝激酶B1(liver-kinase B1，LKB1)和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CAMKⅡ)的蛋白水平出現(xiàn)顯著的降低。并且AMPK、ULK1、p-AMPK、p-ULK1和AMPK上游調(diào)節(jié)激酶在263K感染后的倉鼠腦組織中表達(dá)水平的變化都呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。
　　體外研究主要是利用

6、羊瘙癢因子chandler株感染的SMB-S15細(xì)胞和經(jīng)戊聚糖硫酸酯治療后康復(fù)的SMB-PS細(xì)胞為研究對象，進(jìn)行AMPK-ULK1信號通路的研究。結(jié)果顯示:SMB-S15細(xì)胞中LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平比SMB-PS細(xì)胞有明顯增加，而泛素結(jié)合蛋白P62(Ubiquitin-conjugates protein62，P62/SQSTM1)蛋白水平出現(xiàn)顯著下降。并且免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):SMB-S15細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的LC3Ⅱ陽性信號的聚集，而

7、在SMB-PS細(xì)胞中只是有少量彌散的點(diǎn)狀信號存在。結(jié)果表明，SMB-S15細(xì)胞中自噬流激活。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SMB-S15細(xì)胞中p-AMPK(Thr172)、ULK1和p-ULK1(Ser555)的表達(dá)水平都有顯著升高，但AMPKα1/2和p-ULK1(Ser757)的表達(dá)水平在兩種細(xì)胞間幾乎沒有差異;SMB-S15細(xì)胞中mTOR的蛋白水平比SMB-PS細(xì)胞出現(xiàn)明顯的降低，而正調(diào)節(jié)自噬的Ⅲ類PI3K復(fù)合物的核心蛋白BECN1只是出現(xiàn)