Nlrp3炎性體活化在白蛋白誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)炎癥損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：蛋白尿是絕大多數(shù)慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者共同的臨床表現(xiàn)。近年來研究證實(shí)，蛋白尿作為一種重要的腎臟毒素可引起腎小管細(xì)胞損傷、小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，最終進(jìn)展為腎小管間質(zhì)纖維化，但具體機(jī)制仍不明確。Nod樣受體(Nod-like receptor, NLR)家族是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一類參與固有免疫和炎癥反應(yīng)的效應(yīng)分子。Nlrp3炎性體通過識別某種非微生物源的“危險(xiǎn)信號”引起caspase-1激

2、活，促進(jìn)炎癥因子白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素-18（interleukin-18，IL-18）的分泌和釋放，介導(dǎo)和參與免疫、炎癥反應(yīng)。本研究旨在通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，觀察Nlrp3炎性體活化在白蛋白誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)炎癥形成中的作用，并探討可能的作用機(jī)制。
　　方法：白蛋白負(fù)荷腎炎模型的建立采用成年雄性Wistar大鼠單側(cè)腎切除術(shù)后5天后隨機(jī)分組，分別給予牛血清白蛋白(bovine serum alb

3、umin，BSA)腹腔注射(5g/kg/d，n=10)和無菌性生理鹽水等體積注射(n=8)。10周后處死大鼠并收集血、尿、腎臟組織標(biāo)本，檢測各組大鼠的尿指標(biāo)及腎功能變化;腎臟病理染色觀察腎組織病理改變;并采用免疫組化觀察腎小管上皮細(xì)胞(tubular epithelial cell，TEC)Nlrp3炎性體的表達(dá)及活化指標(biāo);通過腎小球、小管分離技術(shù)將新鮮腎臟組織進(jìn)行管、球分離，Real time RT-PCR及Western blott

4、ing檢測Nlrp3的表達(dá)及炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)。體外研究中培養(yǎng)人近端TEC(human proximal tubular epithelial cell line，HK-2)，并用不同濃度(5 mg/ml，10 mg/ml，20 mg/ml，40 mg/ml) BSA、不同時(shí)間點(diǎn)(6，12，24，48h)刺激，通過real timeRT-PCR、Western Blotting檢測Nlrp3、ASC及炎性體活化標(biāo)志物c

5、aspase-1，IL-1beta，IL-18的基因和蛋白水平表達(dá);激光共聚焦顯微鏡檢測HK-2胞漿內(nèi)的Nlrp3、ASC表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)線粒體與Nlrp3共定位;同時(shí)用ELISA法分析上清培養(yǎng)液中IL-1beta和IL-18的分泌情況;流式細(xì)胞檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況;使用體外Nlrp3 siRNA、megalin、cubilin基因沉默及mROS清除劑NAC，觀察白蛋白刺激后HK-2細(xì)胞IL-1β、IL-18的表達(dá);收集臨床IgA腎病

6、病理標(biāo)本，通過免疫組化檢測Nlrp3和IL-18的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴與生理鹽水組相比，蛋白負(fù)荷組大鼠出現(xiàn)明顯蛋白尿，尿液NGAL、NAG表達(dá)量升高，伴有TEC萎縮、脫落，小管腔明顯擴(kuò)張，腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。蛋白負(fù)荷組大鼠TECNlrp3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)增加。在IgA腎病患者病理標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，Nlrp3和IL-18的表達(dá)位于TEC，且和患者蛋白尿水平及腎小管間質(zhì)炎癥程度密切相關(guān)。⑵體外實(shí)

7、驗(yàn)，HK-2細(xì)胞在白蛋白的干預(yù)下，megalin、cubilin受體表達(dá)呈時(shí)間和濃度依賴趨勢，但在40mg/ml白蛋白刺激下兩種蛋白表達(dá)明顯下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默megalin、cubilin及megalin-cubilin基因后，白蛋白刺激Nlrp3、IL-1β和IL-18的表達(dá)明顯降低。⑶白蛋白刺激HK-2細(xì)胞，胞漿內(nèi)Nlrp3，pro-caspase-1，pro-IL-1β，pro-IL-18基因和蛋白表達(dá)水平較對照

8、組明顯增加，并且呈時(shí)間和濃度依賴趨勢;細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌的成熟IL-1β，IL-18水平顯著增加;激光共聚焦結(jié)果顯示20mg/ml BSA刺激24h組HK-2胞漿內(nèi)的Nlrp3表達(dá)上調(diào)，ASC斑點(diǎn)形成;與對照組相比，BSA刺激后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空泡性改變，線粒體腫脹明顯呈“氣球樣”變，嵴間隙水腫，基質(zhì)密度不均;Nlrp3 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)BSA刺激后，Nlrp3 siRNA降低白蛋白作用下IL-1β和IL-18（炎性體活化標(biāo)志

9、物）的表達(dá)Nlrp3及其效應(yīng)炎癥因子蛋白和基因水平表達(dá)明顯降低。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)能夠增加細(xì)胞內(nèi)mROS的清除，并且減少Nlrp3、IL-1β和IL-18的表達(dá)。
　　結(jié)論：蛋白尿能夠誘導(dǎo)TEC損傷、小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。該過程可能與白蛋白激活TECNlrp3炎性體有關(guān)，其中megalin-cubilin受體介導(dǎo)的白蛋白重吸收及線粒體mROS產(chǎn)生增加可能在這一信號通路中發(fā)揮了重要作用