NLRP3、NLRP1炎性體信號通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫機(jī)制中的作用.pdf

1、第一部分
　　 NLRP3、NLRP1炎性體信號通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫機(jī)制中的作用
　　 背景:
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythcmatosus，SLE)是一種常見的自身免疫性疾病，可引起皮膚、血液、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)損害，以T、B淋巴細(xì)胞活化，大量自身抗體生成，補(bǔ)體激活，免疫復(fù)合物清除障礙為特征。狼瘡腎炎(Lupus Nephritis，LN)是SLE最常見和最嚴(yán)重的臨床表

2、現(xiàn)，腎衰竭是SLE死亡最常見的原因。SLE的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，目前一般認(rèn)為其發(fā)病是遺傳、感染、藥物、雌激素水平、飲食等多種因素共同作用于機(jī)體產(chǎn)生的異常炎癥性免疫反應(yīng)。過去對SLE的研究多集中于適應(yīng)性免疫方向，近年來隨著人們對固有免疫認(rèn)識的不斷深入，固有免疫在自身免疫性疾病中的作用越來越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)固有免疫和適應(yīng)性免疫均參與SLE發(fā)病機(jī)制。
　　 固有免疫又稱為非特異性免疫，能快速識別并清除入侵機(jī)體的病原微生物，被認(rèn)為機(jī)

3、體防御的第一道防線，參與固有免疫的細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。固有免疫細(xì)胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體上的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patten，PAMP)吞噬病原體，進(jìn)而啟動有效的免疫應(yīng)答。NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)為近來研究較多的模式識別受體，N

4、LR屬于胞漿型，NOD樣受體3(NLRP3)和NOD樣受體1(NLRP1)是調(diào)節(jié)炎性體活化及組裝的兩個重要受體。在感染等因素誘導(dǎo)下， NLRP3和NLRP1炎性體通過凋亡相關(guān)點狀蛋白(apoptosis associated speck like protein containing aCARD，ASC)招募半胱氨酸酶1前體(pro caspase-1)，活化caspase-1，形成NLRP3炎性體和NLRP1炎性體，Caspase-1

5、進(jìn)一步將IL-1和IL-18前體裂解為有活性的IL-(1)β和IL-18，參與炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)。以往對NLRP3、NLRP1炎性體的活化機(jī)制及其效應(yīng)的研究主要集中在固有免疫細(xì)胞中，在SLE中的研究尚不多見，故對NLRP3、NLRP1炎性體組分的深入研究將進(jìn)一步闡明SLE的發(fā)病機(jī)制，為治療提供新靶點。
　　 目的:
　　 檢測NLRP3、NLRP1炎性體信號通路相關(guān)分子在SLE及正常人外周血單個核細(xì)胞(perip

6、heral blood mononuclear cell，PBMC)、粒細(xì)胞(granulocyte)、狼瘡腎炎(Lupus nephritis，LN)腎組織及正常腎組織中的表達(dá)水平，比較其差異性，并檢測NLRP3、NLPR1炎性體組分在糖皮質(zhì)激素治療前后的變化，探討NLRP3、NLRP1炎性體信號通路在SLE炎癥反應(yīng)中可能的作用。
　　 方法:
　　 1.詳細(xì)收集39例SLE患者和31例正常對照者的臨床資料，分離PBM

7、C和粒細(xì)胞。
　　 2.采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR)技術(shù)檢測NLRP3、NLRP1炎性體在SLE及正常對照組PBMC、粒細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平，比較其差異性;分析NLRP3、NLRP1炎性體組分與SLE病情活動指標(biāo)的相關(guān)性;并檢測下游炎癥因子IL-1β mRNA的表達(dá)水平。
　　 3.檢測SLE患者初次治療

8、前后（潑尼松60mg/d）NLRP3、NLRP1炎性體組分的表達(dá)變化。
　　 4.采用免疫組化的方法檢測NLRP3、ASC、IL-1β在LN腎組織及正常腎組織中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.NLRP3、NLRP1炎性體組分的表達(dá)水平
　　 1.1SLE組與正常對照組PBMC、粒細(xì)胞中NLRP3、NLRP1炎性體組分及下游分子IL-1β的表達(dá)
　　 1.1.1半定量RT-PCR結(jié)果顯示，SL

9、E患者PBMC中NLRP3 mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(0.425±0.242vs0.834±0.357)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.0035;NLRP1mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(0.504±0.096vs1.398±0.729)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.0002; Caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(0.2205±0.1164vs0.8352±0.2030)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.0002; ASC m

10、RNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(0.6874±0.3166vs1.246±0.6848)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.035。
　　 1.1.2實時定量RT-qPCR結(jié)果顯示，SLE患者PBMC中NLRP3mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(0.641±0.551vs1.320±1.023)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.0009;NLRP1mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(0.604±0.384vs1.260±0.619)，有統(tǒng)計學(xué)差異

11、，P=0.0001; Caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(1.126±1.028vs2.598±1.777)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.0300; IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(1.033±0.899vs2.017±0.516)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P=0.0357。
　　 1.1.3 SLE患者粒細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(1.767±1.370vs0.8019±0.683

12、6)，有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.0408)。
　　 1.2 LN患者腎組織中NLRP3、ASC、IL-1β炎性小體的表達(dá)
　　 與正常腎組織相比，NLRP3炎性小體在LN腎組織中染色強(qiáng)度明顯降低，且著色強(qiáng)度與腎臟病理類型有關(guān)，其中Ⅱ型狼瘡腎炎腎組織NLRP3著色最深，Ⅲ型著色次之，Ⅳ型著色最淺。ASC、IL-1β炎性小體在狼瘡腎組織中表達(dá)，其中在Ⅱ型腎組織中表達(dá)最多，在Ⅲ型和Ⅳ型狼瘡腎組織中表達(dá)較Ⅱ型降低。
　　 2

13、.NLRP3、NLRP1炎性體組分間的關(guān)聯(lián)分析
　　 結(jié)果顯示SLE患者PBMC中NLRP3mRNA表達(dá)水平與Caspase-1呈正相關(guān)(r=0.7405，P＜0.0001)，與IL-1β mRNA呈正相關(guān)(r=0.6085，P=0.0053)，與NLRP1mRNA呈正相關(guān)(r=0.7055，P＜0.0001); NLRP1mRNA表達(dá)水平與Caspase-1呈正相關(guān)(r=0.8010，P＜0.0001)，與IL-1β mRNA

14、呈正相關(guān)(r=0.4745，P=0.0053); Caspase-1mRNA表達(dá)水平與IL-1β mRNA呈正相關(guān)(r=0.5175，P=0.0010)。
　　 3.SLE患者NLRP3、NLRP1炎性體組分mRNA的表達(dá)水平與反映疾病活動臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析
　　 3.1與SLEDAI的相關(guān)性分析
　　 SLE患者PBMC中NLRP3mRNA表達(dá)水平與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3959，p=0.0205

15、);NLRP1mRNA表達(dá)水平與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4113，p:0.0174);ASC mRNA表達(dá)水平與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4860，p:0.0087);Caspase-1mRNA表達(dá)水平與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3989，p:0.0215)，IL-1β mRNA表達(dá)水平與SLEDAI無顯著關(guān)聯(lián)。
　　 3.2與抗ds-DNA抗體的關(guān)聯(lián)分析
　　 SLE患者PBMC中NLRP3mRNA

16、表達(dá)水平與抗ds-DNA抗體呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5493，p=0.0011);NLRP1mRNA表達(dá)水平與抗ds-DNA抗體呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4077，P=0.0281); Caspase-1mRNA表達(dá)水平與抗ds-DNA抗體呈負(fù)相關(guān)(r:-0.4002，P:0.0284)，ASC、IL-1β mRNA表達(dá)水平與正常對照組相比無明顯差異。
　　 3.3與抗AunA抗體的相關(guān)性分析
　　 SLE患者PBMC中NLRP1

17、mRNA表達(dá)水平與抗AunA抗體呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3357，p=0.0486);Caspase-1mRNA表達(dá)水平與抗AunA抗體呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3699，p=0.0372); IL-1β mRNA的表達(dá)水平與抗AunA抗體呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3544，p=0.0465)，NLRP3、ASCmRNA表達(dá)水平與正常對照組相比無明顯差異。
　　 4.糖皮質(zhì)激素對SLE患者PBMC中NLRP3、NLRP1炎性體組分表達(dá)水平的影響

18、
　　 糖皮質(zhì)激素治療后，NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β mRNA恢復(fù)高表達(dá)水平，有統(tǒng)計學(xué)差異，(P=0.0237、P=0.0436、P=0.0252、P=0.0148)。
　　 結(jié)論:
　　 1.SLE患者PBMC中NLRP3、NLRP1、Caspae-1炎性小體較正常對照組呈低表達(dá)，且經(jīng)潑尼松治療后恢復(fù)高表達(dá)水平，IL-1β在SLE患者粒細(xì)胞中低表達(dá)，提示NLRP3、NLRP1炎性體組

19、分參與SLE發(fā)病機(jī)制。
　　 2.SLE患者NLRP3、NLRP1炎性體表達(dá)水平與病情活動指標(biāo)（SLEDAI、抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體）呈負(fù)相關(guān)，提示NLRP3、NLRP1炎性體表達(dá)水平可作為SLE病情活動程度的指標(biāo)，推測可能是SLE治療的新靶點。
　　 3.與正常腎組織相比，NLRP3炎性小體在LN腎組織中低表達(dá)，且表達(dá)水平與腎臟病理類型相關(guān)，由Ⅱ型LN到Ⅳ型LN表達(dá)水平逐漸降低，與外周血PBMC中表達(dá)趨勢一

20、致，提示NLRP3信號通路參與LN腎損害的發(fā)生。
　　 第二部分
　　 NLRP3、NLRP1炎性體信號通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫機(jī)制中的作用
　　 背景:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵犯四肢關(guān)節(jié)為主要臨床表現(xiàn)，以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其病因不明，病程及預(yù)后差異大，目前已證實RA是基因、環(huán)境多種因素共同作用的結(jié)果。固有免疫和適應(yīng)性免疫

21、均參與RA發(fā)病機(jī)制。
　　 NLRP3、NLRP1炎性體是啟動固有免疫及適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵NOD受體，通過結(jié)合蛋白ASC結(jié)合Caspase-1前體，使其活化剪切形成有活性的Caspase-1形式，活化的Caspase-1使IL-1β前體以IL-1β形式成熟和釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。對NLRP3、NLRP1炎性體活化機(jī)制及其效應(yīng)的研究主要集中在固有免疫細(xì)胞，在RA中的研究尚不多見。
　　 目的:
　　 本研究主要是通

22、過探索RA患者PBMC和粒細(xì)胞中NLRP3、NLRP1炎性體的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析，初步探討NLRP3、NLRP1炎性體信號通路在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法:
　　 1.詳細(xì)收集36例RA患者和30例正常對照者的臨床資料，分離PBMC和粒細(xì)胞。
　　 2.采用RT-qPCR方法檢測NLRP3、NLRP1炎性體在RA及正常對照組PBMC、粒細(xì)胞mRNA的表達(dá)水平，比較其表達(dá)差異性;分析NLRP3

23、、NLRP1炎性體組分與抗CCP抗體、RF、ESR的相關(guān)性;并檢測下游炎癥因子IL-1β mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.NLRP3、NLRP1炎性體組分的表達(dá)
　　 1.1 RA患者與正常對照者PBMC中NLRP3、NLRP1炎性體組分的表達(dá)
　　 RA患者PBMC中NLRP1、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平低于正常對照組(0.9441±0.6233vs1.414±1.023，0.8

24、690±0.8496vs1.344±1.676)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P值分別為0.0457、0.0273; NLRP3、ASC、IL-1β mRNA表達(dá)水平與正常對照組相比無顯著差異。
　　 1.2RA患者與正常對照組粒細(xì)胞中NLRP3、NLRP1炎性體組分的表達(dá)
　　 RA患者粒細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組(0.761±0.789 vs1.627±2.110,0.611±

25、0.411 vs1.123±0.837,0.528±0.298 vs0.887±0.742)，有統(tǒng)計學(xué)差異，P值分別為0.0489、0.0064、0.0249。
　　 2.RA患者PBMC中NLRP3、NLRP1炎性體組分表達(dá)水平與抗CCP抗體、RF、ESR的相關(guān)性分析
　　 RA患者PBMC中NLRP1 mRNA表達(dá)水平與抗CCP抗體呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.3674，P=0.0354)，與RF呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.4

26、189，P=0.0332），與ESR無明顯關(guān)聯(lián);IL-1β mRNA表達(dá)水平與RF呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.3948，P=0.0340).
　　 結(jié)論:
　　 1.NLRP1、Caspase-1炎性小體在RA患者外周血PBMC中表達(dá)下調(diào)，NLRP3、ASC、Caspase-1在RA患者粒細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示NLRP3、NLRP1炎性體可能作為保護(hù)性分子參與RA免疫機(jī)制。
　　 2.NLRP1表達(dá)水平與抗CCP抗體、