NLRP3在柯薩奇病毒誘導(dǎo)的病毒性心肌炎中的作用及其機制.pdf

1、病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染為起因，以心肌壞死及大量炎性細(xì)胞浸潤為特征的感染性心臟疾病，好發(fā)于青壯年。發(fā)病率為10％~20%，近年來呈現(xiàn)上升趨勢。病毒性心肌炎患者大部分病情發(fā)展為自限性，但其中約有10%~15%的病例由于病程遷延不愈，可使疾病從急性期轉(zhuǎn)為慢性期甚至演變?yōu)閿U張性心肌?。―ilated Cardial Myopathy，DCM）和充血性心衰，后兩者成為心臟移植的首要指征，五年存活率僅

2、為25%，目前尚無有效的治療方法仍以預(yù)防為主。能引起病毒性心肌炎的病毒以柯薩奇病毒B組（coxsackie virus B，CVB）最為常見又尤以血清型3型（CVB3）致病性最強，其屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。目前認(rèn)為，CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎發(fā)病機制一方面是由于CVB3病毒對心肌的直接破壞作用，另外一方面是由于機體過強的免疫反應(yīng)造成的間接損傷。
　　以往研究通過調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答如抑制Th1增強Th2，或者抑制Th17增強T

3、reg細(xì)胞等，均發(fā)現(xiàn)在病毒性心肌炎中具有一定的保護效應(yīng)。近年來研究顯示病毒性心肌炎小鼠模型感染早期心臟中就有白細(xì)胞介素（interleukin，IL）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等炎癥因子出現(xiàn)，并且中和炎癥因子IL-1β可顯著抑制心肌炎的發(fā)生。此外，心臟中浸潤的炎性細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞達(dá)浸潤細(xì)胞總數(shù)的40.6%，其次為T淋巴細(xì)胞占33.6%，上述研究均提示固有免疫應(yīng)答在疾病早期即可影響炎癥反應(yīng)的進(jìn)程

4、和發(fā)展，對于調(diào)控后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的類型偏向及疾病發(fā)生發(fā)展具有決定性作用。然而目前對于病毒性心肌炎固有免疫應(yīng)答的啟動和維持機制尚不明確。炎性小體作為固有免疫的重要組成部分對IL-1β的成熟釋放起著決定性作用。IL-1β在機體內(nèi)是以未成熟的前體形式存在，炎性小體能夠直接或者通過接頭蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD）募集半胱天冬蛋白酶的前體procasp

5、ase-1，形成一個蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)而調(diào)節(jié)caspase-1的活化，激活的caspase-1對IL-1β細(xì)胞因子前體pro-IL-1β進(jìn)行切割加工，使其成熟并分泌到細(xì)胞外。目前發(fā)現(xiàn)NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2可以形成炎性小體。其中研究最多并能感知RNA病毒炎癥小體為NLRP3，NLRP3不僅可以識別PAMP，也可以識別機體本身細(xì)胞釋放的危險相關(guān)分子模式（danger-associated molecular pattern

6、，DAMP）分子，其識別譜十分廣泛。由于能被多種類型的病原體或者危險信號所激活，NLRP3炎癥小體在多種疾病過程中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括最初被確認(rèn)的家族性寒冷性蕁麻疹綜合征(familial cold urticaria syndrome，F(xiàn)CUS)，隨后發(fā)現(xiàn)的阿爾茨海默病、2型糖尿病和動脈粥樣硬化等。
　　因此，作為炎癥反應(yīng)的核心NLRP3是否能夠感知CVB3，在VMC發(fā)病中的作用還不明確。因此我們重點研究了CVB3誘導(dǎo)的病毒性

7、心肌炎小鼠模型中NLRP3通路的活化及其作用；并且對CVB3刺激引起NLRP3活化的分子機制進(jìn)行了探討。
　　第一部分CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎中NLRP3通路顯著活化
　　病毒性心肌炎中細(xì)胞因子的產(chǎn)生有賴于機體對病毒的固有免疫識別，但在CVB3感染過程中是否會引起NLRP3的激活以及炎癥小體的形成還不十分清楚。本部分研究我們通過腹腔注射CVB3（Nancy株）建立急性VMC小鼠模型，動態(tài)監(jiān)測NLRP3及其炎癥小體形成的情況

8、，發(fā)現(xiàn)感染組小鼠出現(xiàn)體重持續(xù)下降，血清中心臟肌鈣蛋白I（cardiac troponinI，cTnI）顯著升高，心臟局部出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤和壞死提示急性病毒性心肌炎小鼠模型成功建立，為下一步的機制研究奠定基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)CVB3感染小鼠IL-1β在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均明顯上調(diào)，并且與反映心肌炎病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)（體重減輕率及心臟炎癥病理評分）均呈線密切正相關(guān)，提示IL-1β參與了CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展。更為重要的是我們發(fā)現(xiàn)能

9、夠感知核酸RNA的炎癥小體成分NLRP3表達(dá)顯著上調(diào)及通路下游信號分子凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1）的表達(dá)也顯著上調(diào)，上述結(jié)果提示CVB3感染可以引起心臟局部NLRP3被激活，并通過ASC和caspase-1通路誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生進(jìn)而加重心肌炎。
　　第二部分NLRP3通路在病毒性心肌炎中發(fā)揮重要致

10、病作用
　　在該部分中我們重點研究NLRP3通路在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎發(fā)生發(fā)展中的作用。我們通過聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine，PEI）包裹質(zhì)粒shRNA-NLRP3，并以脂質(zhì)體復(fù)合物的形式尾靜脈注射小鼠特異性下調(diào)體內(nèi) NLRP3分子來觀察CVB3感染小鼠心肌炎病情的改變。經(jīng)Western Blot證實感染第七天小鼠心臟和脾臟中NLRP3分子的表達(dá)量顯著減少，下調(diào)效率分別達(dá)到約95%和92%，并于感染第七天檢

11、測小鼠心肌炎的嚴(yán)重程度。我們發(fā)現(xiàn)NLRP3下調(diào)組小鼠CVB3感染后心臟和血清中IL-1β的含量僅為339.8±7.781（pg/100mg）和111.0±16.28（pg/ml）較對照組528.0±15.32（pg/100mg）和467.7±6.562（pg/ml）顯著下降；隨后心臟病理學(xué)觀察顯示心臟炎癥細(xì)胞浸潤較對照組明顯減少；體重下降情況也顯著改善；同時NLRP3下調(diào)組的生存率由對照組的50%顯著提高到80%。并且shRNA-NLR

12、P3組較空載組心臟收縮功能明顯增強，主要表現(xiàn)為左心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）為76.98±1.660（%）高于對照組20.54±1.740（%），左室短軸收縮率（fraction shortening，F(xiàn)S）44.40±1.266（%）較對照組19.34±0.9161（%）顯著升高。上述結(jié)果顯示下調(diào)NLRP3可顯著減輕CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎的病情，提示NLRP3通路可通過促進(jìn)炎癥因子IL-1β加重心臟局部

13、炎性細(xì)胞浸潤及心肌壞死，在病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的致病作用。
　　第三部分CVB3刺激可顯著活化巨噬細(xì)胞NLRP3通路
　　病毒性心肌炎患者及 CVB3感染小鼠模型的心肌組織中均存在大量單個核細(xì)胞浸潤，其中以巨噬細(xì)胞為主（占浸潤白細(xì)胞50%以上），并且巨噬細(xì)胞主要聚集于損傷部位，提示與心肌細(xì)胞損傷關(guān)系密切。同時我們前期研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可以通過分泌大量的促炎因子IL-1β、TNF-α等參與病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展，N

14、LRP3作為重要的免疫分子是否參與巨噬細(xì)胞的促炎表型和維持尚不清楚，因此本部分我們主要研究病毒性心肌炎中巨噬細(xì)胞NLRP3活化情況。我們首先檢測了CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎小鼠心臟局部能形成炎性小體 NOD家族成員 NLRP1、NLRP3和NLRC4 mRNA水平，結(jié)果顯示僅NLRP3表達(dá)升高。然后我們進(jìn)一步在體外直接用CVB3刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，結(jié)果也僅見NLRP3 mRNA的水平上升且上調(diào)呈現(xiàn)與 CVB3刺激劑量和

15、刺激時間的依賴性。而當(dāng)下調(diào) RAW264.7巨噬細(xì)胞NLRP3分子后，CVB3刺激產(chǎn)生IL-1β的能力顯著降低。隨后我們在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞及骨髓來源的巨噬細(xì)胞中進(jìn)一步驗證了上述現(xiàn)象，我們同樣發(fā)現(xiàn)CVB3刺激后可以上調(diào)原代巨噬細(xì)胞NLRP3的mRNA表達(dá)促進(jìn)IL-1β的生成。通過上述體內(nèi)外實驗我們發(fā)現(xiàn)通過 CVB3可以活化巨噬細(xì)胞 NLRP3通路并促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生，然而其具體機制尚不明確。
　　第四部分CVB3活化巨噬細(xì)胞N

16、LRP3通路的機制探討
　　通過上述研究我們發(fā)現(xiàn) CVB3刺激可以活化巨噬細(xì)胞 NLRP3通路并促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生，在該部分中我們主要探討了CVB3活化巨噬細(xì)胞NLRP3通路的具體機制。首先我們通過免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn) CVB3可以進(jìn)入巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)，并與NLRP3分子共定位，提示NLRP3可能參與CVB3病毒的感知。然而當(dāng)我們以Real-Time PCR的方法檢測病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制情況時發(fā)現(xiàn)病毒正鏈和負(fù)鏈的數(shù)量均無變化，提示

17、該病毒并不能在巨噬細(xì)胞中有效復(fù)制。此外當(dāng)我們用基因中含有GFP的CVB3（CVB3-GFP）來刺激巨噬細(xì)胞時，胞內(nèi)并未檢測到帶有GFP蛋白的病毒顆粒，上述結(jié)果均提示CVB3并不能在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄擴增。由此也提示我們只有在復(fù)制過程中產(chǎn)生的分子并不為NLRP3所感知，而有可能感知的是病毒結(jié)構(gòu)成分。為了證實這一想法我們隨后用野生型和熱滅活的 CVB3分別作用于RAW264.7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者同樣能使NLRP3激活由此提示CVB3的組

18、成可以激活NLRP3。為進(jìn)一步確定到底是哪一結(jié)構(gòu)組成活化了NLRP3，我們分別檢測了CVB3的基因組RNA以及病毒合成的相關(guān)蛋白VP0，VP1，3AB，3CD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中只有VP1可以顯著上調(diào)NLRP3分子的表達(dá)，表明CVB3可以通過VP1蛋白活化巨噬細(xì)胞NLRP3通路。
　　綜上所述我們發(fā)現(xiàn)NLRP3分子在病毒性心肌炎中顯著上調(diào)表達(dá)，并在心肌炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的致病作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CVB3病毒可以通過VP1蛋白活化