Galectin-9在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用及其機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是一臨床常見心血管系統(tǒng)疾病。早在1899年Fiedler KL就曾報道過3例現(xiàn)代概念的VMC,此后,歐美各國VMC的臨床及尸檢報道日益增多。20世紀70年代后,中國及日本等亞洲國家相繼報道了VMC的發(fā)生,近年來尤其在我國,VMC的發(fā)病逐年上升,VMC已成為青少年不明原因猝死的主要原因之一。不僅如此,慢性VMC??蓪?dǎo)致擴張性心臟病的發(fā)生,在美國每年新增擴張性心臟病病人多達100,0

2、00人,已成為心臟移植手術(shù)的重要原因之一。VMC嚴重危害生命健康,然而迄今為止,VMC的治療尚無有效的辦法,其根本原因在于VMC的發(fā)病機制還不完全清楚,因此,闡明VMC的發(fā)病機制具有重要的理論和實踐意義。
  目前認為,VMC的發(fā)生是一個多因素參與的復(fù)雜的過程,病毒感染是VMC重要的病因之一。腸道病毒、巨細胞病毒、腺病毒、流感病毒、肝炎病毒等病毒感染都可以誘發(fā)VMC。其中腸道病毒尤其是柯薩奇病毒感染是最常見病因。B3型柯薩奇病毒(

3、coxsackievirus group B type 3,CVB3),微小無衣殼正鏈RNA病毒,屬于小核糖核酸病毒科。早在20世紀50年代,B3型柯薩奇病毒已被發(fā)現(xiàn)能累及心肌,導(dǎo)致VMC。流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn),CVB3感染在不同性別人群中發(fā)病率和嚴重程度明顯不同,VMC在男性人群中多發(fā),癥狀也較為嚴重,并易發(fā)展為慢性心肌炎和擴張性心肌病。與人類相似,CVB3感染的雌性和雄性BALB/c小鼠也顯示不同嚴重程度的心肌炎。盡管CVB3感染的發(fā)

4、病機制已經(jīng)研究了很多年,但直到近來才發(fā)現(xiàn)多種機制參與了CVB3誘導(dǎo)的VMC的發(fā)生、發(fā)展和進程。
  CD4+T細胞的免疫偏移可以影響VMC嚴重性。一方面,Th1型免疫應(yīng)答被認為是引起心肌組織損傷的主要原因:有研究發(fā)現(xiàn),CD4基因敲除小鼠中CVB3誘導(dǎo)的VMC可以得到有效的緩解,證實了CD4+T細胞在VMC中的作用;Huber等也發(fā)現(xiàn)CD4+Th1細胞應(yīng)答對于CVB3誘導(dǎo)的VMC是必需的。另一方面,CD4+調(diào)節(jié)性T細胞(regula

5、tory T cells,Tregs)可以降低心肌炎癥,緩解心肌炎的發(fā)??;Ono等發(fā)現(xiàn),高表達GITR的Foxp3+Tregs可以控制自身免疫性心肌炎;Huber等證實CVB3病毒突變體可以通過誘導(dǎo)和維持Tregs的數(shù)量,有效的緩解心肌炎。
  炎性細胞因子在VMC的發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用。在易感小鼠中,心肌組織中IL-1β和IL-18水平的增加直接與疾病的嚴重性呈正相關(guān);在非易感小鼠中,IL-1或TNF-α卻能促進心肌炎的發(fā)病

6、。本室前期研究發(fā)現(xiàn),外源性注射IL-4可以顯著改善CVB3感染小鼠的心肌炎癥和心肌炎的嚴重程度。因此,治療CVB3誘導(dǎo)的VMC理想的方法就是促進細胞因子向抗炎因子轉(zhuǎn)化,同時誘導(dǎo)或擴增抑制性細胞如CD4+Tregs。
  Galectin-9,β半乳糖苷結(jié)合凝集素家族成員,可誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞、腫瘤細胞和T細胞凋亡。通過Ca2+-caspasel信號途徑,galectin-9能優(yōu)先誘導(dǎo)活化CD4+T細胞發(fā)生凋亡。T細胞免疫球蛋白域和粘

7、蛋白域蛋白-3(T-cell immunoglobulindomain and mucin domain protein-3,Tim-3),galectin-9的受體,選擇性表達于終末分化Th1細胞,在Th17、Tregs表面也有一定的表達。Galectin-9在體內(nèi)外均可以誘導(dǎo)Tim-3表達的細胞發(fā)生凋亡。有研究發(fā)現(xiàn),galectin-9治療可以有效的緩解實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦炎,一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦炎。而且,在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動物模型以及

8、HSV誘導(dǎo)的損傷模型中,galectin-9通過調(diào)節(jié)T細胞應(yīng)答,如抑制Th17的產(chǎn)生,同時促進Tregs的分化和擴增,從而達到治療疾病的目的。
  在本研究中,我們用CVB3感染的雄性BALB/c小鼠,觀察CVB3感染后心肌中g(shù)alectin-9的表達變化,結(jié)果顯示CVB3感染后雄性BALB/c小鼠心肌galectin-9的表達顯著升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)galectin-9可以促進Tregs的富集,并有效的緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC。

9、那么galectin-9是通過什么機制緩解VMC的發(fā)作?是影響病毒復(fù)制還是通過調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答?Galectin-9促進Tregs富集的機制又是什么?因此,在本研究中我們利用CVB3感染的VMC模型,探討了Ralectin-9在VMC發(fā)病中的作用及相關(guān)機制。
  第一部分Galeetin-9在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用
  一、CVB3感染前后galectin-9的表達變化
  Galectins屬于β半乳糖苷結(jié)合凝集素

10、家族?,F(xiàn)有的研究表明,galectins在各種生理或病理過程中發(fā)揮重要作用,如免疫炎癥反應(yīng)、腫瘤、動脈粥樣硬化和糖尿病等。其中g(shù)alectin-1,-3,-9在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
  為了研究galectins在CVB3誘導(dǎo)的VMC中的作用,我們首先觀察了CVB3感染前后小鼠心肌中g(shù)alectin-1,-3,-9的表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CVB3感染可以顯著上調(diào)小鼠心肌galectin-1,-9 mRNA的表達。由于

11、galectin-1在病毒感染中研究較為清楚,我們進一步關(guān)注了CVB3感染前后galectin-9在不同組織中的表達變化,發(fā)現(xiàn)CVB3感染后,小鼠心肌、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中g(shù)alectin-9 mRNA的表達顯著升高。免疫組化結(jié)果也顯示CVB3感染增加了小鼠心肌中g(shù)alectin-9蛋白的表達。
  述結(jié)果提示,galectin-9可能參與了CVB3誘導(dǎo)的VMC的發(fā)病。
  二、Galectin-9治療前后BALB/c小鼠病

12、毒性心肌炎嚴重程度的差異
  VMC以心肌間質(zhì)炎性細胞浸潤為特征,導(dǎo)致心肌細胞灶性壞死,纖維化,最終導(dǎo)致心臟功能喪失。以CVB3感染小鼠建立心肌炎動物模型,很好地模擬了臨床上VMC疾病過程。VMC的判斷指標主要有體重減輕、血清學、病理學以及死亡率等。用galectin-9蛋白腹腔注射治療CVB3感染雄性BALB/c小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組小鼠在感染后第3天體重都開始下降,其中未治療組(PBS組)小鼠體重持續(xù)下降,至第7天體重減輕率達15

13、%,而galectin-9治療組BALB/c小鼠感染后第5天體重開始恢復(fù),隨后體重逐漸增加。從血清學指標來看,在感染后第7天,未治療組BALB/c小鼠血清CK、CK-MB的活性顯著升高,cTnI水平也明顯升高;而galectin-9治療組小鼠血清CK、CK-MB的活性和cTnI水平顯著低于未治療組小鼠。心臟組織HE染色顯示未治療組BALB/c小鼠心臟顯示片狀的炎性細胞浸潤和心肌細胞壞死,而galectin-9治療組小鼠心臟僅有少量炎性細

14、胞浸潤;治療組小鼠心肌炎的炎癥面積遠小于未治療組,而且治療組小鼠心臟浸潤CD45+單個核細胞比例顯著降低。最后,從死亡率來看,至感染第10天,未治療組BALB/c小鼠的死亡率高達70%,而galectin-9治療組小鼠的死亡率僅為15%。綜合上述各項指標可以看出,galectin-9治療可以顯著緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC。
  三、Galectin-9治療對CVB3感染小鼠炎癥性細胞因子分泌的影響
  炎癥性細胞因子如TNF-

15、α、IFN-γ、IL-4和IL-10等在心肌炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。因此,我們檢測了galectin-9治療對小鼠心臟局部和血清中炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10分泌的影響,發(fā)現(xiàn)galectin-9治療可以顯著下調(diào)促炎性細胞因子FNF-α和IFN-γ的分泌,同時促進抗炎性細胞因子IL-4和IL-10的分泌。
  以上結(jié)果顯示,galectin-9可以有效的緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC,并促進細胞因子微環(huán)境向

16、抗炎性轉(zhuǎn)化,證實galectin-9的確參與了VMC的發(fā)病。
  第二部分Galectin-9在病毒性心肌炎中的作用機制探討
  一、Galectin-9對病毒復(fù)制的影響
  CVB3感染心肌細胞是誘發(fā)VMC的前提條件。由此我們必須排除一個可能即galectin-9緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC是由于降低心肌病毒復(fù)制造成的。因此我們首先檢測了galectin-9治療前后CVB3感染的BALB/c小鼠心臟組織中CVB3病毒RN

17、A數(shù)量和病毒滴度的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin-9并沒有引起心臟組織中CVB3病毒RNA數(shù)量和病毒滴度的改變。
  二、Galectin-9對細胞免疫應(yīng)答的影響
  由于galectin-9緩解VMC并沒有降低心肌病毒復(fù)制,我們進一步探討了galectin-9治療對細胞免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果顯示CVB3感染過程中,galectin-9可以顯著降低小鼠心臟和脾臟中CD4+T細胞的比例,同時增加Tregs、CD11b+及Gr-1

18、+細胞的數(shù)量。由于Tim-3(galectin-9特異性受體)和TLR4的相互作用在VMC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,我們還檢測了galectin-9對Tim-3和TLR4在免疫細胞表面表達的影響,發(fā)現(xiàn)galectin-9降低了CD4+T細胞Tim-3的表達,但其在巨噬細胞表面的表達顯著升高;同時galectin-9顯著降低了TLR4在CD11b+細胞及巨噬細胞表面的表達。
  上述結(jié)果提示,galectin-9緩解CVB3誘導(dǎo)的V

19、MC并不是直接降低病毒復(fù)制,而是通過調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答參與心肌炎的發(fā)病,Tregs和CD11b+細胞可能參與其中。
  前面的實驗結(jié)果顯示,galectin-9可以有效的緩解CVB3誘導(dǎo)的VMC,我們進一步探討了其可能的細胞學機制以及是否這種作用依賴于效應(yīng)T細胞數(shù)量的降低和Tregs數(shù)量的升高。
  三、Galectin-9對于CD4+T細胞凋亡和增殖的影響
  現(xiàn)有的研究表明,galectin-9可以優(yōu)先誘導(dǎo)效應(yīng)CD4

20、+T細胞的凋亡,而在CVB3誘導(dǎo)的VMC模型中,分泌IFN-γ的CD4+T cells是影響疾病嚴重性的重要因素。因此,我們首先檢測了galectin-9對CD4+T細胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)galectin-9可以顯著促進CD4+T細胞發(fā)生凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn),galectin-9主要誘導(dǎo)CD4+CD25low/int效應(yīng)T細胞凋亡(>90%),而對于CD4+CD25highTregs的促凋亡作用甚微(<10%)。我們同時也檢測了galec

21、tin-9對CD4+T細胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)galectin-9能抑制CD4+T細胞增殖,并主要抑制CD4+CD25low/int效應(yīng)T細胞的增殖,而并不影響CD4+CD25high Tregs的增殖。Galectin-9差異調(diào)節(jié)Tregs和效應(yīng)T細胞凋亡和增殖可能是由于其受體Tim-3的表達差異造成的,相關(guān)機制仍需進一步研究。
  四、Galectin-9在誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞分化中的作用
  Tregs在CVB3誘導(dǎo)的VMC的

22、發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。為了探討galectin-9是否影響Tregs應(yīng)答,我們檢測了galectin-9對Tregs分化的影響,發(fā)現(xiàn)galectin-9能促進CVB3感染的裸鼠心臟和脾臟中CD4+CD25T細胞向Tregs轉(zhuǎn)化。
  五、Galectin-9在擴增CD11b+Gr-1+細胞中的作用
  前面的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),galectin-9能顯著增加CD11b+和Gr-1+細胞的比例,而CD11b和Gr-1是髓系來源抑制

23、細胞(myeloid suppressor cells,MSCs)的特有表型,于是我們檢測了galectin-9在調(diào)節(jié)CD11b+Gr-1+細胞擴增中的作用,結(jié)果顯示galectin-9能顯著擴增CD11b+Gr-1+細胞。通過分析這群細胞的表型和細胞因子分泌情況,我們發(fā)現(xiàn)其具有髓系來源抑制細胞的表型。
  許多研究表明,髓系來源抑制細胞可以促進Tregs的擴增。因此,我們接著研究了CD11b+Gr-1+細胞在擴增Tregs中的作

24、用,結(jié)果顯示,CD11b+Gr-1+細胞可以促進CD4+T細胞中Tregs的擴增,這種作用部分依賴于IL-10,而不依賴于TGF-β。
  綜上所述,本研究首次闡明了galectin-9在CVB3誘發(fā)的VMC發(fā)病中的作用;證實了galectin-9是通過調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答參與了VMC的發(fā)病,并未影響病毒復(fù)制;多種機制參與了galectin-9對VMC的調(diào)節(jié);Galectin-9差異調(diào)節(jié)效應(yīng)T細胞和Tregs增殖和凋亡;CD11b+G

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