TLR13和腸道菌群在柯薩奇病毒性心肌炎發(fā)病中的作用及其機制.pdf

1、病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是一類由病毒感染引起的以心肌局灶性或彌漫性炎癥為主要特征的臨床常見心血管系統疾病。VMC全球發(fā)病率估計在0.12-12％之間,近年來我國VMC發(fā)病率呈上升趨勢,發(fā)病率約為5％-15％,已成為青少年猝死的主要原因之一。急性VMC患者起病隱秘性和缺乏治療手段,因此其真實發(fā)病率往往被低估。急性VMC還可遷延進展為慢性心肌炎或致死性擴張性心肌病(Dilated cardiomyopath

2、y,DCM)。VMC已成為影響人類健康的一類重要的心血管感染性疾病,然而迄今為止尚無有效的治療方法,根本原因在于VMC的發(fā)病機制尚未明確。因此,闡明VMC的發(fā)病機制具有重要的理論和實踐意義。
　　病毒感染是VMC發(fā)病的主要病因。腸道病毒、腺病毒、流感病毒、巨細胞病毒等都能誘發(fā)VMC,其中腸道病毒尤其是B3型柯薩奇病毒(Coxsackievirus B type3,CVB3)感染引起的VMC占腸道病毒感染誘發(fā)的心肌炎病人數一半以上。

3、CVB3為微小無衣殼正鏈RNA病毒,屬于小核糖核酸病毒科。CVB3經糞口途徑感染食道和胃腸道之后,經由柯薩奇-腺病毒受體(Coxsackie-adenovirus receptor,CAR)和輔助受體衰變加速因子(Decay accelerating factor,DAF)感染腸道,病毒入血后感染胰腺和心肌細胞,在感染的第7-10天誘導急性胰腺炎和急性心肌炎,并在感染一個月后可誘導慢性心肌炎。
　　病毒性心肌炎的發(fā)病機制長期受到關

4、注:已知CVB3的裂解性復制直接破壞心肌細胞;CVB3還通過編碼Pro2A和衣殼蛋白VP2誘導心肌細胞凋亡。研究報道VMC易感性不同的雌雄小鼠在病毒感染后第7天,心肌中的病毒載量相當。此外,利用基因敲除小鼠(TLR3-/-,TRIF-/-,CD4-/-,MyD88-/-等)證明易感性不同的小鼠卻有著相似的心肌病毒載量,提示病毒復制在CVB3誘導的心肌炎發(fā)病中并非至關重要的因素。越來越多的研究結果表明,雖然 CVB3在感染早期可直接導致心

5、肌細胞壞死,但CVB3感染誘導的心肌局部炎癥細胞浸潤和炎癥損傷是VMC發(fā)病的主要原因。心肌局部浸潤的免疫細胞包括Th1、Th17淋巴細胞、M1型巨噬細胞和嗜中性粒細胞,以巨噬細胞為主。上述免疫細胞分泌的炎癥細胞因子如IL-6、IL-17是主要的心肌炎炎癥相關細胞因子。我們實驗室前期研究給VMC小鼠輸注Th2型細胞因子如IL-4和IL-13和M2型巨噬細胞或體內誘導Th2型極化具有治療VMC的作用。
　　眾所周知,固有免疫是機體抗感

6、染過程中的第一道防線。近年來,固有免疫越來越受到關注,因其在啟動和調控后續(xù)適應性免疫應答格局起重要作用,并且固有免疫也不再是人們之前認為的“非特異”免疫。固有免疫細胞如巨噬細胞和DC表面或胞內的多種模式識別受體(PRRs)通過識別病原體特定的病原相關分子模式(PAMPs),激活固有免疫信號通路,啟動促炎因子和I型干擾素分泌和抗原提呈相關分子(MHCII和B7)高表達,因此固有免疫對特異性免疫應答T、B淋巴細胞的活化不可或缺。而固有免疫一

7、旦失控往往導致各類炎性疾病,如炎癥性腸病(IBD)和自身免疫病(SLE)。以往對VMC的研究重點大多放在適應性免疫應答,特別是Th1、Th17、Treg等在VMC發(fā)病中的作用及機制,而針對VMC固有免疫的研究較少。因此,本研究提出如下假設:在炎癥性Th1/Th17應答誘導之前,心臟局部的炎癥性固有免疫對于炎癥的誘導和放大、對于Th1/Th17應答的激活發(fā)揮了關鍵的作用,經心臟局部PRR信號通路激活的炎癥性固有免疫在VMC發(fā)病中扮演關鍵的

8、初始作用。研究CVB3感染早期在腸道和心臟局部激活的關鍵的模式識別受體,及其啟動的促炎信號和炎癥效應及抗病毒效應,進而對炎性Th1/Th17細胞浸潤至心肌組織造成免疫損傷的影響,對于闡明VMC的發(fā)病機制提出了創(chuàng)新性的思路。
　　過去的研究提示TLR3/TLR4/TLR7/8/9和MDA5都參與了抗CVB3的固有免疫的激活,其中TLR3激活上調的表達發(fā)揮了顯著的心肌炎保護作用而TLR4激活則加劇心肌炎癥和小鼠死亡,MDA5在VMC中

9、的作用仍存在爭議。除了上述PRRs,我們認為應全局性地動態(tài)檢測CVB3感染后腸道和心臟局部所有TLRs和病毒識別RLRs的表達譜系改變,從中篩選出與VMC發(fā)病最為相關的PRR,進行深入研究非常重要。由此,我們發(fā)現了過去未曾報道的新PRR---TLR13。TLR13是近年才發(fā)現的一類表達于細胞內體膜上的新型PRR,迄今為止其功能未完全闡明。2012年發(fā)現TLR13的天然配體是革蘭氏陽性和陰性細菌23SrRNA上的一段保守序列;TLR13還

10、被報道參與對水皰口炎病毒(VSV)的識別。
　　為了深入研究固有免疫受體在CVB3感染早期在腸道和心臟局部的激活及其炎癥效應對于病毒性心肌炎發(fā)病的關鍵作用,本研究中,我們通過CVB3感染雄性BALB/c小鼠建立的VMC小鼠模型,首先以實時定量PCR技術跟蹤分析了15種PRRs在CVB3感染過程中的表達變化,由此發(fā)現TLR13的表達最為顯著性地上調。在此基礎上,通過體內外TLR13表達下調,研究了TLR13在VMC發(fā)病中的關鍵作用,

11、并對其激活的抗病毒機制和炎癥機制進行了深入研究。
　　此外,考慮到CVB3隸屬于腸道病毒屬,而腸道細菌格局可影響機體免疫系統及感染性疾病的發(fā)病。我們提出初步假設:是否CVB3感染通過影響腸道正常菌群的格局發(fā)生改變,依次誘導胃腸道、腸系膜淋巴結和心肌局部的免疫反應,從而影響了病毒性心肌炎的發(fā)生。擬在VMC易感性不同的雌雄小鼠模型基礎上,首先用高通量測序方法分析了雌雄小鼠腸道菌群的多樣性及豐度差異,并通過灌服腸道液體的方法,初步探討了

12、腸道菌群改變對VMC致病的影響,該部分為次要研究和探索性研究,尚未形成明確的結論。
　　第一部分 CVB3誘導心肌炎急性期心肌組織PRRs動態(tài)表達譜
　　一、CVB3致小鼠病毒性心肌炎模型的建立
　　以CVB3感染小鼠建立的VMC動物模型與臨床VMC病患特征相似,主要的判斷指標有生存率、體重減輕率、血清學、病理學等。以103TCID50的CVB3經腹腔感染BALB/c雄小鼠,發(fā)現感染后第3天開始小鼠體重明顯下降,感染第

13、7天體重下降率達20％;且7天小鼠死亡率為50％。從血清學指標看,病毒感染后第7天小鼠血清中肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平顯著性升高。病理學指標是VMC最重要的判斷標準,感染第7天的小鼠心臟石蠟切片H.E染色顯示:心臟組織中有大量炎性細胞浸潤以及大片心肌細胞壞死,而正常小鼠心肌細胞完整,無炎癥細胞浸潤。綜合上述指標,已成功建立了CVB3感染誘導的VMC小鼠模型。
　　二、VMC小鼠心臟組織PRRs表達譜的動態(tài)改

14、變
　　為了尋找在VMC發(fā)病中可能起重要作用的PRRs,選擇了15種PRRs(TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR5,TLR6,TLR7,TLR8,TLR9,TLR11,TLR12,TLR13,RIG-I,MDA5,LGP2),在CVB3感染誘導的VMC小鼠模型中,以實時定量PCR分析這些PRRs的動態(tài)表達變化,結果顯示:病毒感染后第4天,心臟組織中大部分PRRs表達顯著升高,至第7天,PRRs的表達均有所下調。其中以T

15、LR13在感染第4天的上調表達最為顯著(p<0.05),增幅近13倍。推測TLR13很可能被CVB3所激活,其介導的固有免疫炎癥參與了VMC的致病過程。
　　第二部分體內下調TLR13表達對于CVB3誘導的VMC的作用
　　一、TLR13敲弱質粒效率的體外、體內驗證
　　由于CVB3感染極顯著地上調TLR13的表達,因此下調TLR13水平對研究其在VMC發(fā)病中的作用至關重要。為有效下調TLR13的表達,設計了針對TLR

16、13的shRNA序列,將其連接入pLL3.7構建了TLR13-ShRNA下調質粒。用Lipofectamine2000將質粒轉染入NIH-3T3細胞中,以實時定量PCR和Western Blot分析了TLR13的mRNA和蛋白水平表達。結果顯示該下調質粒能顯著下調細胞中TLR13的表達,體外下調效率達50％以上。為研究TLR13在VMC小鼠中的真實作用,需在體內將小鼠心臟局部的TLR13水平下調。采用In vivo JET-PEI技術將

17、下調質粒通過PEI以眼眶靜脈注射途徑注射入動物體內,檢測基因表達干擾效果,發(fā)現,給予下調質粒第5天,心臟組織TLR13表達量已顯著降低90％以上,且下調效率能持續(xù)至第7天。
　　二、心臟局部下調TLR13水平對VMC炎癥的影響
　　為了研究TLR13在VMC發(fā)病中的作用,小鼠設立正常組(A組)、單獨感染CVB3組(B組)、空質粒合并CVB3感染組(C組)以及TLR13下調合并CVB3感染組(D組),于-4天、0天給小鼠注射T

18、LR13下調質粒二次,于0天感染CVB3病毒。結果顯示感染后7天,對照組小鼠心肌組織炎性細胞浸潤嚴重,而TLR13下調組生存率顯著提高、體重保持不變、血清CK和CK-MB活性顯著下降,最重要的,心肌組織炎性細胞浸潤明顯改善,表明在心臟局部下調TLR13表達后可顯著緩解CVB3誘導的VMC小鼠心肌炎炎癥程度。
　　三、心臟局部TLR13下調對心臟病毒載量及心臟炎癥細胞因子的影響
　　為了研究TLR13下調對心肌組織病毒 RNA

19、載量及心肌細胞因子的影響,病毒感染第7天將小鼠處死。結果顯示與空質粒組和對照組小鼠相比,TLR13下調組小鼠心臟病毒RNA載量顯著降低;心臟炎癥細胞因子水平較感染了CVB3的兩組對照小鼠顯著下降,其中Th1型細胞因子(IFN-γ、TNF-α)降幅達50％以上,表明體內下調TLR13水平能顯著降低CVB3誘導的炎癥性Th1型應答,并降低病毒復制水平,對機體起保護作用。
　　四、心臟局部TLR13下調對心臟功能的影響
　　病毒感

20、染第7天,采用超聲診斷儀對小鼠心臟行超聲檢測。結果顯示,與正常小鼠相比,TLR13下調組心臟左心室收縮末期內徑顯著增大,左室射血分數及左室短軸縮短率數值均顯著降低,說明病毒感染后VMC小鼠心臟收縮功能減退,而對照小鼠則出現一定的心臟擴張顯現。提示體內TLR13水平下調可降低CVB3誘導的病毒性心肌炎的后遺癥-擴張性心臟病的可能。
　　第三部分 TLR13介導的炎癥固有免疫和抗病毒反應在VMC發(fā)病中的分子機制探討
　　一、CV

21、B3刺激TLR13介導的NF-κB信號通路激活的炎癥效應為了研究CVB3感染后TLR13在炎性反應和抗病毒作用中的分子機制，我們選擇了支持CVB3復制的Hela細胞（天然缺陷TLR13），利用真核表達質粒將TLR13過表達于人源Hela細胞株中。結果顯示，我們成功構建了pTLR13真核表達質粒，并在細胞中顯著表達。在轉染并高表達TLR13的Hela細胞中，轉染含有NF-κB啟動子的熒光素酶報告質粒，以CVB3病毒和TLR激動劑ORN S

22、a19刺激后，檢測熒光素酶活性。結果顯示，以CVB3病毒感染過表達TLR13的Hela細胞后，NF-kB啟動子活性比空質粒轉染組活性顯著提高近50％，提示TLR13識別CVB3后可激活下游NF-κB信號通路。
　　二、CVB3刺激TLR13介導的IFN-β信號通路激活的抗病毒效應在轉染并高表達TLR13的Hela細胞中，轉染含有IFN-β啟動子的熒光素酶報告質粒，以CVB3病毒和TLR激動劑ORN Sa19刺激后，檢測熒光素酶活性

23、。結果顯示，以CVB3病毒感染過表達TLR13的Hela細胞后，IFN-β啟動子活性比空質粒轉染組活性顯著提高。同時我們在心肌細胞株HL-1中過表達TLR13，并感染標記綠色熒光的CVB3-eGFP，感染24小時后，流式檢測病毒載量。與空質粒組相比，TLR13過表達組中攜帶綠色熒光的HL-1細胞顯著減少，提示TLR13識別CVB3后可激活下游IFN-β信號通路，發(fā)揮抗病毒效應。
　　第四部分 腸道菌群與雌雄小鼠VMC易感性差異的關

24、系的初步探究
　　一、CVB3感染后雌雄BALB/c小鼠心肌炎的差異以CVB3感染BALB/c雌雄小鼠，比較VMC發(fā)病率。發(fā)現感染后第7天雄小鼠死亡率為50％，而雌小鼠死亡率僅為10％。從心臟病理看，雄小鼠心臟組織中有大量炎性細胞浸潤和心肌細胞壞死，而雌小鼠僅有少量炎性細胞浸潤。從炎癥細胞因子水平看，病毒感染后第7天雄小鼠心肌Th1型促炎細胞因子（IFN-γ、TNF-）顯著高于雌小鼠（p<0.05），提示誘導Th1型免疫；而雌小鼠

25、Th2型細胞因子（IL-10、IL-13）水平顯著高于雄小鼠（p<0.05），提示誘導Th2型免疫。綜上所述，與雌小鼠相比，雄小鼠對CVB3易感，可誘導顯著的急性病毒性心肌炎，與其體內誘導的Th1型免疫相關。
　　二、正常雌雄小鼠小腸組織中細胞因子本底表達的差異雌雄小鼠在感染CVB3后心臟炎癥細胞因子水平差異顯著，而腸道細胞因子表達無性別差異。為排除不同性別小鼠腸道本底細胞因子水平的影響，檢測正常雌雄小鼠腸道細胞因子的本底水平，發(fā)

26、現雌小鼠腸道細胞因子（IFN-γ、TNF-、IL-10、IL-13）的本底表達量均高于雄小鼠，特別是Th2型細胞因子水平顯著高于雄鼠（IL-10、IL-13），因腸道本底細胞因子水平與感染無關，而與腸道菌群和性別相關，推測雌雄小鼠對VMC易感性可能與腸道菌群調節(jié)的腸道細胞因子水平有一定關系。
　　三、正常雌雄小鼠腸道菌群譜系的差異腸道菌群不僅可阻止病原菌入侵腸道，還能與腸道免疫細胞相互作用影響機體免疫功能。推測正常雌雄小鼠的腸道細