單基因疾病的分子診斷教材

1、分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診斷，也能 確定個體對疾病的易感性，判別致病基因攜帶者并 對疾病的分期、分型、療效監(jiān)測和預(yù)后作出判斷? 分子診斷已成為實驗診斷學(xué)的一個重要組成部分,第十三章 單基因疾病的分子診斷,,,,,分子診斷不僅廣泛應(yīng)用于單基因疾病、多基因疾病、感染性疾病和腫瘤疾病的診斷中，而且在癥狀前診斷、產(chǎn)前診斷、植入前診斷等各時期的檢查中，以及在法醫(yī)學(xué)、移植配型、耐藥性研究、個性化治療和預(yù)防醫(yī)學(xué)檢驗中發(fā)揮著重

2、要作用。,分子診斷學(xué)的發(fā)展,第一代遺傳標志（RFLP）限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism） 在人類基因組中，不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶切該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。 由于DNA分子產(chǎn)生突變，使某些限制性酶切位點數(shù)增加、減少或移位，導(dǎo)致限制性酶切片段長度發(fā)生改變。,,RFLP的優(yōu)點：1）無表型效應(yīng)

3、，其檢測不受環(huán)境和發(fā)育階段的影響。2） RFLP標記在等位基因之間是共顯性的，在配制雜交組合時不受雜交方式的影響。3）在非等位的RFLP標記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾。4） RFLP標記源于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制。,,RFLP的缺點：1）酶切只能產(chǎn)生2-3個片段，可提供的信息量有限。2）有時需要用放射性同位素標記的DNA片段作為探針檢測RFLP。3） 無法克服RFLP多態(tài)信息含量低的缺陷。,分子診

4、斷學(xué)的發(fā)展,第二代遺傳標志（STR）短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat） 人類基因組DNA有3×109bp，其中10%是串聯(lián)重復(fù)序列，稱為衛(wèi)星DNA（satellite DNA）?？煞譃榇笮l(wèi)星、中衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星。 重復(fù)單位由2-6bp組成的叫微衛(wèi)星，也稱它為短串聯(lián)重復(fù)序列。,,人類基因組DNA中平均每6-10kb就有一個STR位點，其多態(tài)性成為法醫(yī)物證檢驗、個人識別和親子鑒定的豐富信息

5、資源。STR標記主要位于非編碼區(qū)，變異一般不影響人體的結(jié)構(gòu)與功能。靈敏度高，ng級DNA就可以有效擴增。適用生物檢材類型十分廣泛，對古代DNA也可檢測。,分子診斷學(xué)的發(fā)展,第三代遺傳標志（SNP）單核苷酸多態(tài)性(single nucletide polymorphism) 在基因組中，不同個體的DNA序列上的單個堿基的差異被稱為單核苷酸多態(tài)性。 基因型：一個人所擁有的一對等位位點的類型被稱為基因型。（genotype）

6、,,SNP的優(yōu)點：1）SNP在基因組中的分布廣泛。2）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。3） SNP是高度穩(wěn)定的。4）部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達水平。5）易于進行自動化、規(guī)?；治觯s短了研究時間。,遺傳性疾?。河捎谌梭w的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變所引起的疾病。致病基因：能夠?qū)е逻z傳性疾病發(fā)生的基因。遺傳性疾病分為兩類：單基因病、多基因病。,單基因?。菏侵敢?/p>

7、種遺傳病的發(fā)生只受一對等位基因控制，他們的遺傳方式遵循孟德爾分離定律。多基因病：兩個以上基因的結(jié)構(gòu)或表達調(diào)控的改變，如糖尿病、高血壓、冠心病、骨質(zhì)疏松癥等。,單基因疾病的三種遺傳方式,1. 常染色體遺傳（autosomal inheritance）包括：常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳。2. X連鎖遺傳（ X-linked inheritance）包括： X連鎖顯性遺傳和X連鎖隱性遺傳。3. 線粒體遺傳（mitochondria

8、l inheritance）,單基因疾病的三種遺傳方式,常染色體遺傳（autosomal inheritance）常染色體顯性遺傳疾病有Huntington病、脊髓小腦性共濟失調(diào)Ⅰ型等。 常染色體隱性遺傳疾病有鐮狀細胞貧血、苯丙酮酸尿癥和先天聾?、裥偷取?單基因疾病的三種遺傳方式,2. X連鎖遺傳（ X-linked inheritance）X連鎖顯性遺傳有遺傳性腎炎、抗維生素D性佝僂病等。X連鎖隱性遺傳：假肥大性肌營養(yǎng)不良、

9、血友病、紅綠色盲等。,3 常見的線粒體疾病,肌陣攣性癲癇伴碎紅纖維病(MERRF)是一種線粒體腦肌病Leber遺傳性視神經(jīng)病(LHON)是一種罕見的眼部線粒體疾病 帕金森?。≒D）,,,,分子診斷的策略,直接診斷基因多態(tài)性連鎖分析基因突變的定量診斷,,直接診斷：直接檢測導(dǎo)致遺傳性疾病的各種基因突變類型：點突變 缺失 插入 倍增前提：基因已

10、經(jīng)克隆，序列和結(jié)構(gòu)清楚,點突變,點突變：DNA分子中單個堿基的替換終止密碼子突變： 點突變導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼，或終止密碼突變而編碼一個氨基酸使肽鏈延長,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,各種點突變所造成的后果： 蛋白質(zhì)分子量改變 蛋白質(zhì)合成量下降 無蛋白質(zhì)合成,,,,,(一)點突變的診斷1、 基因背景清楚的點突變等位基因特異性寡核苷酸雜交(allele spec

11、ific oligonucleotide, ASO)限制性片段長度多態(tài)性分析PCR-RFLP測序基因芯片技術(shù),2、基因背景未知的點突變單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformational polymorphism, SSCP)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)異源雙鏈分析(heteroduplex analysis, HA)DN

12、A序列測定蛋白截短測試（protein truncation test, PTT）,片段性突變,核苷酸的丟失和增多缺失：基因中堿基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù),一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,(二)片段性突變的檢測片段性突變是指DNA分子較大范圍發(fā)生突變， 堿基的缺失、插入、擴增和重組。（1）少數(shù)核苷酸缺失或插入 檢測點突變的方法（2）大的片

13、段突變 Southern印跡技術(shù)、多重PCR技術(shù)。,動態(tài)性突變,以三核苷酸為單位的重復(fù)序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復(fù)。 少年脊髓型共濟失調(diào)：GAA重復(fù)。 ……,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,二、基因多態(tài)性連鎖分析檢測原理：多態(tài)性連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析檢測前提：致病基因尚未被定位和闡明

14、 基因太大、突變種類太多檢測方法：RFLP，STR，SNP,,三、基因突變的定量診斷檢測內(nèi)容：大范圍的重復(fù)、缺失檢測方法：細胞分裂中期染色體檢測 固相雜交 PCR 擴增,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略,2.間接診斷策略,,,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略基因診斷的

15、直接策略就是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.間接診斷策略,間接診斷的實質(zhì)是在家系中進行連鎖分析，通 過分析可確定個體是否存在雙親同源染色體中 的致病染色體 間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過 分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性估計被檢者患病的 可能性,,,,

16、一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,連鎖分析(linkage analysis): 是通過用一系列覆蓋密度適當(dāng)?shù)倪z傳標志在先證者家系中進行分析，從而找到與某一遺傳標志緊密連鎖的致病基因，并確定該基因在染色體上的位置。,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（三）基因診斷所采用的技術(shù),,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,3.間接診斷所采用的技術(shù),1.直接診斷所采用的技術(shù),1.直接診斷所采用的技術(shù),Southern 印

17、跡技術(shù)多重PCR技術(shù)PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性寡核苷酸（ASO）DNA芯片技術(shù)（DNA chip）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）變性梯度凝膠電泳（DGGE）DNA序列分析（DNA sequencing）,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,定量PCR技術(shù)DNA結(jié)合染料技術(shù)水解探針技術(shù)雜交探針技術(shù),一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,3.間接診斷所采用的技術(shù),

18、間接診斷就是分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性 （1）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） 第一代DNA的遺傳標志，具雙等位基因多態(tài)性，所含信息量有限 。 檢測方法：Southern印跡技術(shù)、PCR-RFLP。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,（2）小衛(wèi)星序列 串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（VNTR），以 6～70bp 為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列。等位基因

19、常常達10個以上，信息量比 RFLP大得多 。 檢測方法：Southern 印跡技術(shù)、PCR技術(shù) 。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（3）微衛(wèi)星序列 以 2～6bp 為單位，重復(fù)次數(shù)可達幾十次，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) ，在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性，屬于第二代的遺傳學(xué)標志 。 檢測方法：PCR技術(shù)、基因掃描 。,,,,,,,一、單基

20、因遺傳性疾病的基因診斷,（4）單核苷酸多態(tài)性(SNP),第三代DNA的遺傳標志，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的變異，在人類基因組中的數(shù)目可達300萬個，由3～4個相鄰的標志便可構(gòu)成8～16種單倍型，是一種信息量非常大的標志系統(tǒng) 。 檢測方法：DNA芯片技術(shù)。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（四）遺傳標志的選擇,選擇離致病基因最近的遺傳標志 遺傳標志離致病基因的距離越遠，二者間發(fā)

21、生重組的可能性越大，二者間距離為1cM(106bp)時，發(fā)生重組的概率為1%,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（五）間接診斷的不確定性,遺傳標志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不夠完整,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,二、單基因病的分子診斷,單基因遺傳病 是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或由其而引起的基因表達異常而導(dǎo)致的疾病,,,,單基因疾病的分子診斷,一、血紅蛋白病二、血友病三、肌營養(yǎng)不良癥四、苯丙酮尿癥

22、五、亨廷頓病六、脆性X綜合征,血紅蛋白病,,單基因病的分子診斷,血紅蛋白病包括：鐮狀細胞貧血、地中海貧血,單基因病的分子診斷,,,Southern blot,分子診斷,,,（一）血友病A的分子診斷（二）珠蛋白合成障礙性貧血的分子診斷,,,,二、單基因病的分子診斷,二、單基因病的分子診斷,1.凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷,2.FⅧ基因的直接檢測（22號內(nèi)含子倒位檢測）,3.FⅧ基因連鎖分析（FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測）,,,,（一

23、）血友病A的分子診斷,血友病A,1. 凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷 主要為點突變和基因缺失 缺失 169 種 插入 28 種 點突變 347 種 第22號內(nèi)含子倒位:40%～50%重型HA,二、單基因病的分子診斷,,,,,,第22號內(nèi)含子倒位的機制,二、單基因病的分子診斷,,,,11kb/,12kb/,12kb/,11kb/12kb,2. FⅧ基因的直接檢測——

24、22號內(nèi)含子倒位檢測,二、單基因病的分子診斷,長距離PCR擴增22號內(nèi)含子,,,,3. FⅧ基因連鎖分析—— FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測,B/,A/,B/C,B/C,C/D,C/,B/D,二、單基因病的分子診斷,PCR檢測VNTR （st14）位點進行家系連鎖分析,,,,血紅蛋白異常包括兩大類 結(jié)構(gòu)變異：珠蛋白鏈上氨基酸序列發(fā)生改 變?nèi)珑牋罴毎氀?珠蛋白鏈合成障礙：一部分珠蛋白鏈合成過多， 一部分珠蛋白鏈合成過少甚

25、至不能合成，如地中 海貧血,二、單基因病的分子診斷,（二）珠蛋白合成障礙性貧血的分子診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（一）單基因疾病中常見的分子異常,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,（三）基因診斷所采用的技術(shù),（四）遺傳標志的選擇,（五）間接診斷的局限,,,,（一）單基因疾病中常見的分子異常,由于一個（或數(shù)個）基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息改變 基因突變主要包括三大類： 點突變、片段性突變和動態(tài)性突

26、變,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,1.點突變,2.片段性突變,3.動態(tài)性突變,,,,1.點突變,點突變：DNA分子中單個堿基的替換終止密碼子突變： 點突變導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼，或終止密碼突變而編碼一個氨基酸使肽鏈延長,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,各種點突變所造成的后果： 蛋白質(zhì)分子量改變 蛋白質(zhì)合成量下降 無蛋白質(zhì)合成,,,

27、,2.片段性突變,核苷酸的丟失和增多缺失：基因中堿基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù),一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,3.動態(tài)性突變,以三核苷酸為單位的重復(fù)序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復(fù)。 少年脊髓型共濟失調(diào)：GAA重復(fù)。 ……,一、單基因遺傳性疾病的基因診

28、斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略,2.間接診斷策略,,,,（二）遺傳性疾病基因診斷的策略,1.直接診斷策略 基因診斷的直接策略就是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.間接診斷策略,間接診斷的實質(zhì)是在家系中進行連鎖分

29、析，通 過分析可確定個體是否存在雙親同源染色體中 的致病染色體 間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過 分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性估計被檢者患病的 可能性,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,連鎖分析(linkage analysis): 是通過用一系列覆蓋密度適當(dāng)?shù)倪z傳標志在先證者家系中進行分析，從而找到與某一遺傳標志緊密連鎖的致病基因，并確定該基因在染色體上的位置,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（三

30、）基因診斷所采用的技術(shù),,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,3.間接診斷所采用的技術(shù),1.直接診斷所采用的技術(shù),1.直接診斷所采用的技術(shù),Southern 印跡技術(shù)多重PCR技術(shù)PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性寡核苷酸（ASO）DNA芯片技術(shù)（DNA chip）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）變性梯度凝膠電泳（DGGE）DNA序列分析（DNA sequencing）,,,,

31、一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,2.基因表達異常的檢測,定量PCR技術(shù)DNA結(jié)合染料技術(shù)水解探針技術(shù)技術(shù)雜交探針技術(shù),一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,3.間接診斷所采用的技術(shù),間接診斷就是分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性 （1）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） 第一代DNA的遺傳標志，具雙等位基因多態(tài)性，所含信息量有限 。 檢測方法：Southern印跡技術(shù)、PCR-RFLP。,一、單

32、基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,（2）小衛(wèi)星序列 串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（VNTR），以 6～70bp 為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列。等位基因常常達10個以上，信息量比 RFLP大得多 。 檢測方法：Southern 印跡技術(shù)、PCR技術(shù) 。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（3）微衛(wèi)星序列 以 2～6bp 為單位，重復(fù)次數(shù)可達幾

33、十次，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) ，在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性，屬于第二代的遺傳學(xué)標志 。 檢測方法：PCR技術(shù)、基因掃描 。,,,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（4）單核苷酸多態(tài)性(SNP),第三代DNA的遺傳標志，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的變異，在人類基因組中的數(shù)目可達300萬個，由3～4個相鄰的標志便可構(gòu)成8～16種單倍型，是一種信息量非常大的標志系統(tǒng) 。 檢測方法：

34、DNA芯片技術(shù)。,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,,,,,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（四）遺傳標志的選擇,選擇離致病基因最近的遺傳標志 遺傳標志離致病基因的距離越遠，二者間發(fā)生重組的可能性越大，二者間距離為1cM(106bp)時，發(fā)生重組的概率為1%,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,（五）間接診斷的不確定性,遺傳標志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不夠完整,,,,一、單基因遺傳性疾病的基因診斷,二、單基因病

35、的分子診斷,單基因遺傳病 是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或由其而引起的基因表達異常而導(dǎo)致的疾病,,,,（一）血友病A的分子診斷（二）珠蛋白合成障礙性貧血的分子診斷,,,,二、單基因病的分子診斷,二、單基因病的分子診斷,1.凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷,2.FⅧ基因的直接檢測（22號內(nèi)含子倒位檢測）,3.FⅧ基因連鎖分析（FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測）,,,,（一）血友病A的分子診斷,血友病A,1. 凝血因子Ⅷ基因的主要遺傳缺陷

36、 主要為點突變和基因缺失 缺失 169 種 插入 28 種 點突變 347 種 第22號內(nèi)含子倒位:40%～50%重型HA,二、單基因病的分子診斷,,,,,,第22號內(nèi)含子倒位的機制,二、單基因病的分子診斷,,,,11kb/,12kb/,12kb/,11kb/12kb,2. FⅧ基因的直接檢測——22號內(nèi)含子倒位檢測,二、單基因病的分子診斷,長距離PCR擴增22號內(nèi)

37、含子,,,,3. FⅧ基因連鎖分析—— FⅧ基因st14位點多態(tài)性檢測,B/,A/,B/C,B/C,C/D,C/,B/D,二、單基因病的分子診斷,PCR檢測VNTR （st14）位點進行家系連鎖分析,,,,血紅蛋白異常包括兩大類 結(jié)構(gòu)變異：珠蛋白鏈上氨基酸序列發(fā)生改 變?nèi)珑牋罴毎氀?珠蛋白鏈合成障礙：一部分珠蛋白鏈合成過多， 一部分珠蛋白鏈合成過少甚至不能合成，如地中 海貧血,二、單基因病的分子診斷,（二）珠蛋白

38、合成障礙性貧血的分子診斷,,,,珠蛋白合成障礙性貧血的遺傳缺陷 （1）α珠蛋白合成障礙性貧血 主要基因缺陷：α珠蛋白基因缺失 檢測方法：Southern印跡技術(shù)、PCR,二、單基因病的分子診斷,,,,,,,α0珠蛋白合成障礙性貧血（α0--SEA型）基因缺失檢測引物部位,,,,二、單基因病的分子診斷,（2）β珠蛋白合成障礙性貧血 基因缺陷：點突變和移碼突變 檢測方法：基因