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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究對(duì)導(dǎo)致Ⅱ型遺傳性抗凝血酶(antithrombin,AT)缺陷癥的突變熱點(diǎn)ATLeu99進(jìn)行了突變蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究,以探討AT Leu99突變導(dǎo)致遺傳性AT缺陷癥的分子機(jī)制。此外,本研究收集了石骨癥(Osteopetrosis)和X連鎖先天性腎上腺發(fā)育不良(X linked adrenal hypoplasia congenita,XL-AHC)等罕見(jiàn)性遺傳病家系,并對(duì)此開展了臨床表現(xiàn)、家系調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和基因診斷(TCIR
2、G1基因、CLCN7基因和NROB1基因)等方面的研究;對(duì)所發(fā)現(xiàn)的CLCN7基因剪接位點(diǎn)突變c.1798-1G>T進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄研究,以探討其導(dǎo)致石骨癥的分子發(fā)病機(jī)制。
AT是人體抗凝系統(tǒng)的主要因子之一,遺傳性AT缺陷癥是由編碼AT蛋白的基因突變所引起,是靜脈血栓栓塞癥的主要遺傳性危險(xiǎn)因素。AT Leu99是導(dǎo)致Ⅱ型AT缺陷癥的突變熱點(diǎn),已在多個(gè)家系中有報(bào)道,本研究構(gòu)建了多種Leu99突變表達(dá)質(zhì)粒(Leu99Phe、Leu99Va
3、l、Leu99Ala、Leu99Ile以及Leu99Ser),在體外探討Leu99突變導(dǎo)致遺傳性AT缺陷癥的分子機(jī)制。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR顯示Leu99突變AT基因和野生型AT(AT WT)基因在轉(zhuǎn)錄水平無(wú)差異;同位素代謝示蹤實(shí)驗(yàn)顯示,Leu99Phe和Leu99Val突變AT表達(dá)受損,分別為AT WT的36.9%和13.8%。采用果蠅S2細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)AT WT和Leu99突變AT進(jìn)行表達(dá)和純化。肝素結(jié)合試驗(yàn)顯示AT Leu99Val
4、、Leu99Ala、Leu99Ile和Leu99Ser突變AT蛋白與低分子量肝素鈉的結(jié)合分別為相同濃度AT WT的(44.8±3.6)%、(118.9±14.0)%、(15.2±8.8)%和(23.0±8.2)%。表面等離子共振實(shí)驗(yàn)顯示AT Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile和Leu99Ser突變蛋白與凝血酶的結(jié)合分別為相同濃度AT WT的13%、57%、3%和29%; AT Leu99Val、Leu99Ala、Leu
5、99Ile和Leu99Ser突變AT蛋白與FXa的結(jié)合分別為相同濃度AT WT的7%、51%、1%和25%。發(fā)色底物法顯示,AT WT及Leu99Val、Leu99Ala、Leu99Ile、Leu99Ser等突變型AT蛋白活性分別為146.5%、21.4%、120.9%、10.8%和39.0%。圓二色性檢測(cè)顯示Leu99突變導(dǎo)致AT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋減少、β-片層增多,可見(jiàn)Leu99位點(diǎn)不同氨基酸側(cè)鏈可引起AT空間構(gòu)象的改變,從而使
6、AT與肝素或凝血酶、FXa等底物的結(jié)合受到不同程度的破壞。AT抗原水平的下降以及AT與肝素和底物的結(jié)合受損,均導(dǎo)致了AT蛋白抗凝活性的下降,從而導(dǎo)致遺傳性AT缺陷癥。
石骨癥是一種罕見(jiàn)的遺傳性骨發(fā)育障礙性疾病,以破骨細(xì)胞異常、骨吸收缺陷及骨硬化為特征,臨床表型及基因型十分多樣。本研究通過(guò)TCIRG1基因和CLCN7基因的檢測(cè),在石骨癥家系先證者中發(fā)現(xiàn)了TCIRG1基因復(fù)合雜合突變:c.909C>A(p.Tyr303X)和c.2
7、008C>T(p.Arg670X)以及CLCN7基因雜合剪接位點(diǎn)突變:c.1798-1G>T。通過(guò)對(duì)先證者外周血白細(xì)胞中的CLCN7因轉(zhuǎn)錄本的分析,發(fā)現(xiàn)CLCN7基因c.1798-1G>T突變導(dǎo)致了2種發(fā)生比例不同的異常CLCN7剪接,其中發(fā)生比例較高的是CLCN7因20號(hào)外顯子缺失,而發(fā)生比例較低的是潛在剪接位點(diǎn)的激活,即CLCN7因20號(hào)外顯子起始處24 bp缺失。TCIRG1基因和CLCN7基因同時(shí)突變的石骨癥病例目前未見(jiàn)報(bào)道;此
8、外,TCIRG1基因c.909C>A p.Tyr303X突變和CLCN7基因c.1798-1G>T突變目前亦未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本研究,該家系先證者確診為常染色體隱性遺傳石骨癥。
XL-AHC是一種罕見(jiàn)的遺傳性腎上腺皮質(zhì)發(fā)育缺陷性疾病,臨床表現(xiàn)輕重不一,NROB1基因突變是導(dǎo)致XL-AHC的致病原因。本研究中XL-AHC家系先證者主要表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能低下伴/不伴低促性腺激素性腺發(fā)育不良,在不同的先證者中共檢測(cè)到7種不同的NROB
9、1基因突變,即c.871T>G(p.Trp291Gly)、c.376G>A(p.Val126Met)、 c.195_207delinsTG(p.Cys66GlyfsX2)、 c.833T>C(p.Leu278Pro)、c.543delA(p.Gly183ValfsX80)、c.1102delT(p.Cys368AlafsX3)以及c.501delA(p.Gly169AlafsX94),其中c.871T>G、c.195_207delins
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