部分遺傳性出血病和血栓病分子發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、本研究對5個(gè)血小板無力癥家系、1個(gè)遺傳性FV缺陷癥家系和1個(gè)遺傳PC缺陷癥家系和1個(gè)遺傳性PS缺陷癥家系分別進(jìn)行了GPIIb/GPIIIa基因、F5基因和PC基因缺陷的研究，同時(shí)對發(fā)現(xiàn)的2種新GPIIb基因突變以及2種F5基因突變進(jìn)行了體外表達(dá)研究，以探討其分子病理機(jī)制。另外，對P-選擇素為靶標(biāo)針對血栓成像的新型磁共振對比劑進(jìn)行研制，并在離體血管和動(dòng)物體內(nèi)血管血栓初步成功顯像。 遺傳性血小板無力癥是一種常染色體隱性遺傳的血小板功

2、能障礙性疾病，由G1anzmann于1918年首先報(bào)道，故又稱為G1anzmann病(Glanzmann thrombasthenia，GT)。本研究中，5個(gè)家系的先證者均表現(xiàn)為出血癥狀，以牙齦出血，鼻出血，皮膚瘀斑為主，女性還表現(xiàn)為月經(jīng)過多且時(shí)間延長。血小板計(jì)數(shù)正常，血涂片上形態(tài)正常的血小板分散存在，無聚集，出血時(shí)間明顯延長，對ADP、腎上腺素、凝血酶、花生四烯酸、膠原等生理性誘聚集反應(yīng)低下，而對瑞斯托霉素的反應(yīng)基本正常。流式細(xì)胞術(shù)檢

3、測血小板膜αIIbβ3，家系1，3，4，5中的先證者血小板表面GPIIb和GPIIIa陽性血小板都極度降低（<10％），表型診斷為GT I型；家系2中的先證者血小板表面GPIIb陽性血小板為63％，平均熒光強(qiáng)度（MFI）明顯減弱僅為2.22（正常對照為6.49）。GPIIIa陽性率為76％，MFI明顯減弱僅為3.01（正常對照為24.5），表型診斷為GT III型?；蚍治霰砻?，家系1中的先證者GPIIb基因表現(xiàn)為純合錯(cuò)義突變10G→A

4、(Arg4Thr)，為國際首次報(bào)道；家系2中的先證者GPIIIa基因表現(xiàn)為兩種不同形式的雜合突變：錯(cuò)義突變1199 G→A（Cys374Tyr）和缺失突變1525delC，1525delC為國際首次報(bào)道；家系3中的先證者GPIIb基因表現(xiàn)為兩種不同形式的雜合突變：剪接位點(diǎn)突變IVS15(-1) delG和堿基缺失2930 delG；家系5中的先證者GPIIb基因存在有2種雜合突變：分別為2223G→T (Leu721Arg)和2671C

5、→T (Gln860Stop)，均為國際首次報(bào)道。家系4中的先證者在GPIIb和GPIIIa基因上均未檢測到突變。 本文將G2223T(Leu721Arg)和C2671T(Gln860Stop)突變分別引入含GPIIb cDNA的PCDM Iib質(zhì)粒，與PCDM IIIa質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，進(jìn)行體外表達(dá)試驗(yàn)。PCDM IIbL721R/PCDM IIIa和PCDM IIbQ860Stop/PCDM IIIa轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞表面

6、CD41(GPIIb)和CD61（GPIIIa）分別為野生型質(zhì)粒表達(dá)的2.1％、31.9％和11％、18％；Western-blot檢測到IIbQ860Stop/PCDM IIIa轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的GPIIb截短蛋白，但并未檢測到PCDM IIbL721R/PCDM IIIa轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的GPIIb蛋白。免疫熒光試驗(yàn)顯示突變蛋白可部分到達(dá)高爾基體。首次在國際上初步闡明了GPIIb基因突變G2223T和C2671T導(dǎo)致I型遺傳性血小板無力癥的分子

7、發(fā)病機(jī)制。 遺傳性凝血因子V缺陷癥，是一種常染色體隱性遺傳性出血性疾病，發(fā)生率約為1/1 000 000。本研究家系中的先證者為53歲男性，平素?zé)o明顯出血癥狀，凝血系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)APTT和PT延長，分別為52s和22.8s，F(xiàn)V：C為5.5％，F(xiàn)V：Ag 33.1％，表型診斷為I型凝血因子V缺陷癥?；蚍治霰砻?，先證者F5基因存在2個(gè)突變，分別為C785T和C1321T突變，兩者位于不同的FV等位基因。點(diǎn)突變C785T和C1321

8、T導(dǎo)致編碼的FV蛋白Ser234Leu和Arg413Cys替換；對101例健康成人的分析均未發(fā)現(xiàn)C785T這一位點(diǎn)突變，排除了基因多態(tài)性的可能。經(jīng)檢索，C785T為國際首次報(bào)道的突變。對于Ser234Leu和Arg413Cys突變，我們進(jìn)行了體外表達(dá)研究。轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒C785T和C1321T細(xì)胞內(nèi)外的FV抗原分別為野生型的36.4％、80.2％和31.9％、37.3％，提示突變導(dǎo)致FV蛋白分泌障礙；蛋白降解抑制試驗(yàn)證實(shí)突變蛋白主要在溶酶

9、體進(jìn)行降解；免疫熒光試驗(yàn)顯示突變蛋白可部分到達(dá)高爾基體。首次在國際上闡明了F5基因突變C785T和C1321T導(dǎo)致I型遺傳性FV缺陷癥的分子發(fā)病機(jī)制。 遺傳性PC缺陷癥和遺傳性PS缺陷癥是一種常染色體遺傳性疾病。本文所研究的兩個(gè)家系，先證者分別為43和23歲男性，表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性下肢深靜脈血栓形成，其父母及其他家族成員無血栓史。先證者1表型檢測僅見PC:Ag和PC:A下降約50％，分別為1.34mg/L和49％，診斷為I型PC缺陷癥

10、。先證者2表型檢測僅見PS:Ag和PS:A下降，分別為8.3mg/L和29％，診斷為I型PS缺陷癥。對先證者1及其家系成員的PC基因所有9個(gè)exon及側(cè)翼序列的測序發(fā)現(xiàn)，先證者及其家系7名成員存在exon9區(qū)8831有G→A雜合無義突變，導(dǎo)致Trp372Stop。對先證者2及其家系成員的PS基因所有15個(gè)exon及側(cè)翼序列的測序發(fā)現(xiàn)，先證者及其家系1名成員存在exon14區(qū)Gln522（CAG）→Stop(TAG)雜合無義突變。對于無義

11、突變Trp372Stop，通過外周血白細(xì)胞的PC異位轉(zhuǎn)錄檢測到來自突變等位基因的異常轉(zhuǎn)錄本，但含量明顯減少，提示mRNA穩(wěn)定性下降而被迅速降解，導(dǎo)致其翻譯相應(yīng)的突變蛋白也減少。Western blot未能檢測到異常截短蛋白，提示突變的截短蛋白可能由于不穩(wěn)定被降解或不能分泌而未能檢測到。 P-選擇素是選擇素家族一種重要細(xì)胞黏附分子，主要由活化的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)或以游離形式分泌于循環(huán)中，啟動(dòng)并參與了靜脈血栓的起始形成。本研究中，

12、在標(biāo)記125I和BSA-(Gd-DTPA)n前后，抗人P-選擇素lectin-EGF功能域鼠源單克隆抗體（PsL-EGFmAb）免疫活性未受影響，標(biāo)記后的PsL-EGFmAb能與受損血管內(nèi)膜結(jié)合。體外血管和模擬血栓成像中，使用PsL-EGFmAb-BSA-(Gd-DTPA)n對比劑成像的血管或血栓塊的亮度明顯強(qiáng)于使用Gd-DTPA對比劑。運(yùn)用犬靜脈血栓模型，在血管損傷后而肉眼血栓未形成時(shí)注入PsL-EGFmAb-BSA-(Gd-DTPA