銀屑病發(fā)病分子機制研究

1、<p>　申請代碼：</p><p>　受理部門：</p><p>　收件日期：</p><p>　受理編號：</p><p><b>　　國家自然科學基金</b></p><p><b>　　申 請 書</b></p><p><b&

2、gt;　　資助類別： </b></p><p><b>　　亞類說明： </b></p><p><b>　　附注說明： </b></p><p><b>　　項目名稱： </b></p><p>　　申 請 者： 電話： <

3、;/p><p><b>　　依托單位： </b></p><p><b>　　通訊地址： </b></p><p>　　郵政編碼： 單位電話： </p><p><b>　　電子郵件： </b></p><p>　　申報日期：

4、 200?年??月??日</p><p>　　國家自然科學基金委員會</p><p>　　基本信息0UQpCL0k</p><p>　　項目組主要成員(國家杰出青年科學基金不填此欄)</p><p>　　說明: 1. 高級、中級、初級、博士后、博士生、碩士生人員數(shù)由申請者負責填報，總人數(shù)自動生成。</p>&

5、lt;p>　　說明: 2. 項目組主要成員不包括項目申請者。</p><p>　　經(jīng)費申請表 （金額單位：萬元）</p><p><b>　　報告正文</b></p><p>　　（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）： </p

6、><p>　　1.    項目的立項依據(jù)</p><p>　　銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫異常疾病，因其具有發(fā)病率較高和主要累及青壯年等特點而在皮膚科臨床和科研領域倍受重視。從病理學上看，角質(zhì)形成細胞增殖和分化的異常，角質(zhì)層中性粒細胞聚集所形成的Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤是銀屑病的三個最主要的特點。盡管三者之間存在非常復

7、雜的相互作用和因果關系，但一般認為，真皮內(nèi)聚集并活化的T淋巴細胞是銀屑病皮損發(fā)生的始動因素，活化的T細胞可產(chǎn)生bEGF，INF-γ和IL-8等細胞/趨化因子，從而導致表皮角質(zhì)形成細胞增殖和分化狀態(tài)的異常并誘導中性粒細胞表皮內(nèi)趨化和聚集[1]。 </p><p>　　從目前銀屑病的藥物治療手段上看，維A酸類藥物和蒽林的主要作用機理是調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的異常增殖和分化狀態(tài)；傳統(tǒng)免疫抑制劑 （糖皮質(zhì)激素和MTX等）以及新

8、型免疫抑制劑（環(huán)孢素A，他克莫司，匹美克莫司，西洛莫司等）的主要作用機理是抑制T細胞的增殖和活化；細胞/趨化因子（TNF-α，CD4，CD25，CD11a，IL-2R，IL-6R，IL-12等）抗體主要是阻斷T細胞活化及其相關作用；IL-8抗體主要是阻斷中性粒細胞的趨化。但由于以上藥物治療手段各自不同的副作用和作用靶環(huán)節(jié)的相對單一性，其治療效果及運用前景尚不能完全令人滿意。因此，我們需要尋找同時參與銀屑病多個病理生理學環(huán)節(jié)的新的靶分子及

9、其適當?shù)囊种仆緩?，從而為開辟銀屑病新的研究領域和探尋銀屑病新的治療手段提供理論依據(jù)。</p><p>　　Basigin/CD147分子是一種屬于免疫球蛋白超家族成員的新型跨膜糖蛋白，本研究組成員曾首次克隆該分子并發(fā)現(xiàn)它廣泛存在于不同組織和細胞中，在細胞粘附及胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[2]。本研究群體從1998年開始圍繞CD147在角質(zhì)形成細胞異常增殖和分化以及皮膚腫瘤中的作用及機制開展了系列研究，并取得了一些

10、原創(chuàng)性的科研成果：首先是明確了CD147位于角質(zhì)形成細胞膜微絨毛的超微分布特點，從而提示這一分子可能在細胞粘附、細胞內(nèi)外分子協(xié)同作用以及細胞膜受體等方面發(fā)揮重要作用[3]；然后，我們又利用大量實驗首次發(fā)現(xiàn)：在皮膚鱗狀細胞癌及惡性黑色素瘤的腫瘤細胞膜上CD147的表達顯著增高，增高表達的CD147分子可以通過誘導腫瘤細胞周圍成纖維細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），從而在多種皮膚腫瘤的浸潤和轉移中發(fā)揮作用[4-7]；另外，我們還率先證實了

11、CD147與生理和病理狀態(tài)下角質(zhì)形成細胞分化狀態(tài)密切相關，是一種新的低分化角質(zhì)形成細胞的標志蛋白，并可能發(fā)揮抑制角質(zhì)形成細胞分化的作用[3，7-9]，從而在“角質(zhì)形成細胞分化異?！边@一層面上為開辟銀屑病新的科研領域提供了一個很有價值的靶分子。</p><p>　　更為引起我們重視的是，幾乎所有的T細胞淋巴瘤細胞中均有CD147分子的增高表達[10]，CD147還被證明與T細胞的發(fā)育[11]、分化[12]，特別是活

12、化[13]密切相關。Kasinrerk 等的早期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PHA誘導活化的T細胞中CD147的表達顯著增高[13]；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，T細胞膜上的CD147分子可以參與CD3介導的T細胞活化[14]；CD98是一種與T細胞等炎癥細胞活化和聚集密切相關的分子，而CD147抗體能抑制CD98介導的炎癥細胞聚集[15]；最近的研究顯示，T細胞膜上的CD147分子可能是通過受體-配體的信息傳導作用影響T細胞的增殖與活化[16]。</p&

13、gt;<p>　　親環(huán)素（cyclophilin, CyP）是一種保守的蛋白家族，存在于包括T細胞在內(nèi)的多種人體細胞中, CyP家族有CyPA、CyPB、CyPC、CyPD等成員，其分子量以及亞細胞定位各不相同。該組蛋白有兩個共同特征，一是具有肽基脯氨酸順/反異構酶活性,可催化細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和轉運；二是能與進入細胞內(nèi)的免疫抑制劑（環(huán)孢素A等）結合形成復合物，該復合物可抑制神經(jīng)鈣調(diào)磷酸酶，進而抑制T細胞核活化因子（NFA

14、T），導致活化T細胞的相關細胞因子基因不能轉錄和翻譯，阻斷T細胞信號傳遞從而實現(xiàn)環(huán)孢素A的免疫抑制作用。此外, CyP還可被活化的T細胞分泌,以細胞因子樣的方式參與多種生理和病理過程。</p><p>　　CyPA是CyP家族的主要成員，由165個氨基酸組成，相對分子量18kDa，約占細胞蛋白總量的0.1％－0.4％，主要位于胞質(zhì)內(nèi)?？捎蒚細胞等炎癥細胞分泌，是一種嗜中性粒細胞[17]、T細胞[18]和嗜酸性粒細

15、胞[19]的趨化因子。實驗證實CyPA的受體與人CD147 cDNA 的核苷酸排列有97％的同源性，作為CyPA的受體，CD147可以在CyPA介導的信號傳遞中發(fā)揮重要作用[20]。作為艾滋病毒整合CyPA分子的受體，CD147參與了艾滋病毒進入和感染宿主細胞的過程[21]。最新的研究顯示，CyPA可以調(diào)節(jié)細胞膜上CD147的表達水平[22,23]。CyPB是CyP家族的另一主要成員，主要存在于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并可分泌到細胞外在細胞間信號

16、傳導中發(fā)揮作用。有研究證實，CD147也是CyPB的細胞膜受體，CD147抗體可阻斷CyPB介導的嗜中性粒細胞趨化[24]。Allain等發(fā)現(xiàn)，CyPB可通過促進T細胞膜上α4β1和α4β7整合素的活化而增強T細胞向細胞外基質(zhì)的粘附，T細胞膜上的CD147是這一信號傳導過程中不可缺少的協(xié)同刺激分子[18]。 </p><p>　　小干擾RNA(siRNA)是一種新近發(fā)現(xiàn)的誘導細胞內(nèi)特定基因沉默的技術。它通過向細胞

17、內(nèi)導入長度為21-23的核苷酸序列，高度特異性地降解同源mRNA序列，從而有效地阻止相應蛋白質(zhì)的表達。近年的研究發(fā)現(xiàn)，將目標基因siRNA轉染原代培養(yǎng)T細胞是一種有效的基因治療手段，在艾滋病等免疫相關性疾病中有很好的臨床運用前景[25，26]。本研究組也于近期成功構建CD147 siRNA 表達載體，將它轉染惡性黑色素瘤細胞后可有效抑制CD147的表達[27，28]，從而為項目的順利開展奠定了很好的實驗基礎。</p>&l

18、t;p>　　因為缺乏理想的動物模型，對銀屑病發(fā)病機制的研究大多停留在體外實驗階段。嚴重聯(lián)合免疫缺陷鼠（SCID鼠）因其獨有的細胞和體液免疫缺陷特點，而被廣泛運用于腫瘤學和器官移植等科研領域。有研究發(fā)現(xiàn)，將銀屑病患者皮膚移植到SCID鼠身上，有很高的移植存活率，且能較好地保存銀屑病的臨床、組織病理和免疫學特點[29,30]。因此，人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型被公認為目前最好的銀屑病實驗動物模型。</p><p

19、>　　國外有研究發(fā)現(xiàn)，在類風濕關節(jié)炎關節(jié)滑液中CyPA的水平和反應性中性粒細胞上CD147的表達水平與疾病的嚴重程度相關[31]，國內(nèi)也有研究證實，在類風濕性關節(jié)炎滑膜組織的中性粒細胞和T細胞中有增高表達的CD147分子[32]。有學者發(fā)現(xiàn)，在銀屑病患者的血清中CypA自身抗體的水平明顯增高[33]，但國內(nèi)外尚無有關CD147分子及其配體，CyPA和CyPB在銀屑病發(fā)病機制中作用的報道。</p><p>　

20、　本研究中，我們將首先了解CD147分子及其配體CyPA和CyPB在Jurkat T細胞，銀屑病患者外周血炎癥細胞和皮損中的表達情況；然后通過CD147 siRNA技術明確CD147分子在Jurkat T細胞和銀屑病患者T細胞增殖、活化及基質(zhì)黏附過程中的作用，以及在CyPA和CyPB介導的中性粒細胞趨化過程中的作用；最后建立人銀屑病皮損-SCID鼠移植動物模型，并通過該模型進一步明確CD147 siRNA能否在體內(nèi)實驗條件下緩解銀屑病皮

21、損發(fā)展的進程。本研究的最終目的在于，明確CD147分子在銀屑病T細胞活化和基質(zhì)黏附以及中性粒細胞趨化等重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機制，明確CD147 siRNA對人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型的效應，為探尋銀屑病新的研究領域和治療方法提供理想的靶分子。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　Schaerli P, Britschgi M, K

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48、t;/p><p>　　李衛(wèi)平，謝震山，康向東等，銀屑病和SLE患者血清抗親環(huán)素A抗體的檢測及意義。上海免疫學雜志，2001，21：17。</p><p>　　2、項目的研究內(nèi)容、研究目標,以及擬解決的關鍵問題。</p><p><b>　　2.1研究內(nèi)容</b></p><p>　?。?） 運用免疫印跡和RT-PCR方法檢測

49、Jurkat T細胞，銀屑病患者外周血T細胞及中性粒細胞中CD147表達水平，Jurkat 和外周血T 細胞中CyPA和CyPB表達水平。</p><p>　　（2） 運用免疫組化法觀察CD147，CyPA和CyPB在銀屑病皮損中的表達和分布特點及其與病情的相關性。</p><p>　　（3） 構建pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒并轉染銀屑病患者外周血T細胞、中性粒細胞和Jurkat

50、 T細胞。</p><p>　?。?） 運用免疫學常規(guī)實驗方法觀察CD147 siRNA轉染對Jurkat 和銀屑病患者T細胞增殖、活化及基質(zhì)黏附作用的影響。</p><p>　　（5） 運用中性粒細胞趨化性實驗（Boyden chamber實驗系統(tǒng)）觀察CD147 siRNA轉染對由CyPA和CyPB介導的中性粒細胞趨化性的影響。</p><p>　　（6） 建立

51、銀屑病實驗動物模型（人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型），并利用局部注射CD147siRNA轉染Jurkat T細胞和患者自體炎癥細胞的方法來觀察其對移植皮損的臨床表現(xiàn)，組織病理和免疫學特點的影響。</p><p><b>　　2.2研究目標</b></p><p>　?。?） 了解CD147分子及其配體CyPA和CyPB在Jurkat T細胞，銀屑病外周血炎癥細胞和皮

52、損中的表達情況。</p><p>　?。?） 通過CD147 siRNA技術明確CD147在Jurkat 和銀屑病患者T細胞增殖、活化及基質(zhì)黏附過程中的作用，及在CyPA和CyPB介導的中性粒細胞趨化過程中的作用。</p><p>　?。?） 建立銀屑病實驗動物模型，并通過該模型進一步明確CD147 siRNA能否在體內(nèi)實驗條件下緩解銀屑病皮損發(fā)展的進程。</p><p

53、>　?。?） 結合本研究和我們前期研究結果，明確CD147分子在銀屑病角質(zhì)形成細胞異常增殖和分化、T細胞活化和基質(zhì)黏附以及中性粒細胞趨化等重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機制，為探尋銀屑病新的研究領域和治療方法提供理想的靶分子。</p><p>　　2.3擬解決的關鍵問題</p><p>　?。?） pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒的構建及其細胞內(nèi)的成功轉染（干擾有效性）；</p&

54、gt;<p>　?。?） 銀屑病實驗動物模型（人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型）的建立；</p><p>　?。?） CD147分子在銀屑病多個重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機制，及其在銀屑病治療領域的開發(fā)運用前景。</p><p>　　3、擬采取的研究方案及可行性分析。</p><p><b>　　3.1 研究方法</b></p&

55、gt;<p>　　3.1.1 研究對象</p><p>　　收集在中南大學湘雅醫(yī)學院三家附屬醫(yī)院皮膚科初次就診，近三個月來未經(jīng)任何系統(tǒng)和局部治療的尋常型銀屑病患者40例和膿皰型銀屑病患者15例，同時收集20例健康人作對照?；颊呓?jīng)皮膚活檢進一步明確臨床診斷，并對銀屑病分型和疾病嚴重程度（PASI積分）進行臨床評估。</p><p>　　3.1.2 Jurkat 和外周血T細胞及

56、中性粒細胞中CD147表達水平的檢測</p><p>　　A．細胞株：人Jurkat T細胞株從中國科學院上海細胞生物所購入，菜用含10% FCS的PPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。</p><p>　　B．外周血T細胞的分離：采用密度梯度離心法分離40例尋常型銀屑病患者、15例膿皰型銀屑病患者和對照組外周血單個核細胞并用E-玫瑰花結法或免疫磁珠法純化T細胞，用PBS洗滌3次,離心后重懸浮于含

57、10% FCS的PPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)備用（部分細胞中加PHA刺激）。</p><p>　　C．外周血中性粒細胞的分離：采用Polymorphprep分離液的梯度離心法分離40例尋常型銀屑病患者、20例膿皰型銀屑病患者和對照組外周血中性粒細胞,用PBS洗滌3次, 離心后懸浮于含10% FCS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)備用。 </p><p>　　D．免疫印跡法檢測CD147的蛋白表達水

58、平：提取Jurkat T細胞，患者T細胞和中性粒細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉膜 至PVDF膜上，經(jīng)封閉后依次加入兔抗人CD147抗體(日本抗體學會制備，鹿大皮膚科贈送)，辣根過氧化物酶標二抗，最后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯色，圖像分析（Adobe Photoshop）。</p><p>　　E．RT-PCR法檢測CD147的mRNA表達水平：用Trizol提取Jurkat T細胞，患者T細胞和中性粒細胞RNA（按

59、說明書進行），定量后用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄用于PCR，CD147上游引物：5'-GCAGCGGTTGGAGGTTGT-3'；下游引物：5'-AGCCACGATGCCCAGGAAGG-3'，建立25μl PCR反應體系，94℃ 4min, 94℃ 50s ,65℃ 50s,72℃ 1min 20s,72℃ 10 min ,循環(huán)數(shù)35次。</p><p>　　3.1.3 Jurk

60、at 和外周血T細胞中CyPA和CyPB表達水平的檢測</p><p>　　A．免疫印跡法檢測CyPA和CyPB的蛋白表達水平：除兔抗人CyPA和CyPB抗體(購自Bioreagents公司)不同外，方法與3.1.2 D相同。</p><p>　　B．RT-PCR法檢測CyPA和CyPB的mRNA表達水平：RNA提取及逆轉錄同前，CyPA上游引物：5'-CACCGTGTTCTTCG

61、ACATTG-3'；CyPA下游引物：5'- CCATGGCCTCCACAATATTC -3'，CyPB上游引物：5'- GGAGATGGCACAGGAGGAAAG -3'；CyPB下游引物：5'- AAGAAACTCACTGGCAGACACG -3'，建立25μlPCR反應體系，94℃ 4min, 94℃ 50s ,60℃ 1min50s,72℃ 1min30s, 72℃ 10

62、min ,循環(huán)數(shù) 36次。</p><p>　　3.1.4 患者皮損中CD147，CyPA和CyPB表達和分布特點的檢測</p><p>　　皮膚活檢取患者皮損和非皮損區(qū)皮膚及對照組皮膚制備石蠟包埋標本，連續(xù)切片，采用免疫組化法分別觀察CD147，CyPA和CyPB在皮膚組織角質(zhì)形成細胞，淋巴細胞和中性粒細胞等細胞成分中的表達和分布特點，并分析其與標本來源，銀屑病分型和疾病嚴重程度間的關

63、系。</p><p>　　3.1.5 pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒轉染Jurkat T細胞，患者外周血T細胞和中性粒細胞</p><p>　　A.材料與試劑：質(zhì)粒pSUPER由我院眼科夏曉波教授惠贈，質(zhì)粒抽提及凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司，RT-PCR試劑盒購自晶美公司，T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶HindⅢ 和BglⅡ 購自Promega公司，轉染試劑lipofacta

64、mine 2000 購自美國invitrogen公司，大腸埃希菌DH5α由我校病原微生物教研室提供。</p><p>　　B.shRNA 的設計和構建：（1）shRNA 設計：根據(jù)shRNA設計原則和CD147編碼序列，設計19-21nt的DNA片段，并利用Blast進行匹配，以確定選定的序列為特異性的序列，設計合成2-4條CD147編碼序列的反向重復序列，如：5’- GATCCCCGTCGTCAGAACACAT

65、CAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTGGAAA-3’和5’- AGCTTTTCCAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACGGG-3’,中間為9個插入序列TTCAAGAGA。合成的DNA兩端設計有HindⅢ 和BglⅡ的酶切位點，便于與pSUPER載體相連接。（2）雙鏈DNA的形成：分別取1μl 3mg/ml 合成的DNA片段，在48μl

66、退伙緩沖溶液中逐步降溫退伙形成雙鏈：94℃ 4分鐘， 80℃ 4分鐘， 75℃ 4分鐘， 70℃ 10分鐘，37℃20分鐘，最后降到4℃ 保存。（3）shRNA的構建：退火形成的雙鏈與HindⅢ 和BglⅡ的酶切線形化后的pSUPER在T4DNA 連接酶的作用下形成</p><p>　　C.轉染細胞:大量抽提重組質(zhì)粒pSUPER/CD147siRNA，并進行DNA定量。待培養(yǎng)細胞生長密度達70-80%時進行轉染，

67、轉染試劑lipofactamine 2000 與質(zhì)粒DNA按1：5進行轉染,同時設pSUPER空白載體和正常細胞為實驗對照組，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-6小時后棄培養(yǎng)液，加入含血清和抗生素的培養(yǎng)液，第2天加入puromycine篩選。</p><p>　　D.建立穩(wěn)定轉染的細胞:（1） 確定篩選細胞的最佳puromycine的濃度：在生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)細胞中加入不同濃度的puromycine,觀察細胞的生長情況

68、，保持生長的最低puromycine濃度即為篩選的最佳濃度。（2）轉染細胞的puromycine篩選：加入最佳濃度的puromycine進行篩選，至正常細胞全部死亡，并長出單個克隆為止。（3）單克隆的挑取和擴增：將待篩選的細胞單克隆挑入24孔板中培養(yǎng)，長滿后傳入培養(yǎng)瓶中批量擴增。</p><p>　　E . 免疫印跡法和RT-PCR檢測CD147的表達并確定抑制效果:方法同3.1.2 D,E。</p>

69、<p>　　3.1.6 轉染CD147siRNA對Jurkat 和患者T細胞增殖和活化的影響</p><p>　　A. T細胞增殖狀況的檢測：實驗分未轉染、空白載體轉染和CD147siRNA轉染的Jurkat/患者T細胞（各1×106 個細胞）等六組，經(jīng)PHA刺激后，于37℃下培養(yǎng)72小時，用常規(guī)MTT法檢測細胞增殖情況。</p><p>　　B. T細胞活化狀況

70、的檢測：實驗分組同上，經(jīng)PHA刺激后，于37℃下培養(yǎng)72小時，采用經(jīng)典的淋巴細胞轉化實驗，并檢測IL-2和γ-干擾素來了解T細胞活化狀況。</p><p>　　3.1.7 轉染CD147siRNA對Jurkat 和患者T細胞基質(zhì)黏附作用的影響</p><p>　　在無菌96孔板中加入纖維結合蛋白（1 μg/100 μl/每孔），經(jīng)4℃過夜固化，包被并用0.5% BSA封閉非特異性結合位點

71、。加入的細胞分未轉染、空白載體轉染和CD147siRNA轉染的Jurkat/患者T細胞（各1×106 個細胞）等六組，經(jīng)37℃ 孵育半小時后，倒去培養(yǎng)液，并用PBS洗去未黏附的T細胞。每孔加入25 L MTT(終濃度5 moL/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO100 uL，震蕩10 min，待紫藍色顆粒完全溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀以490 nm 為檢測波長，測各孔的A490值，并利用標準曲線量化黏附的T細胞數(shù)量（每組3個，重復三

72、次，計數(shù)平均值）。</p><p>　　3.1.8 轉染CD147siRNA對由CyPA和CyPB介導的中性粒細胞趨化性的影響</p><p>　　中性粒細胞趨化性實驗仍采用我們曾成功用于檢測皮膚腫瘤細胞遷移情況（國家自然科學基金，30200248）的博伊登室（Boyden chamber）實驗系統(tǒng)，并作適當改動。博伊登室由上室和下室組成，上、下室由不含聚維酮的聚碳酸酯膜分隔，膜上有3-

73、µm小孔，可通過趨化的中性粒細胞。上室中加入的細胞分為未轉染、空白載體轉染和CD147siRNA轉染的中性粒細胞等三組，下室分為不加T細胞、加Jurkat/患者T細胞和加入經(jīng)CyPA或CyPB抗體處理的Jurkat/患者T細胞七組。37℃ 孵育1小時后取下聚碳酸酯膜，采用膜染色細胞計數(shù)法檢測膜底面的中性粒細胞數(shù)（每組3個，重復三次，計數(shù)平均值）。</p><p>　　3.1.9 人銀屑病皮損-SCID

74、鼠移植模型的建立</p><p>　　十位尋常型銀屑病患者的新鮮皮損（五位健康成人皮膚為對照）將作為供體使用，選擇6-8周的SCID鼠為移植受體。每位供體取七塊0.8×0.8cm大小皮片（銀屑病皮損的臨床表現(xiàn)相同）分別移植于七只SCID鼠背部，單線可吸收縫合，無菌紗布覆蓋直至10天后愈合。</p><p>　　3.1.10 移植皮片內(nèi)細胞注射及組織學分析</p>

75、<p>　　移植后第3周根據(jù)移植皮損的鱗屑多少、隆起和紅斑情況對其進行臨床積分評價（分為0-3分四級）。移植后第3周和第4周將用PBS稀釋的細胞（200μl）注射到移植皮損的皮下（Jurkat 細胞組僅于第4周注射1次）。注射分七組：生理鹽水組；Jurkat 細胞組；CD147siRNA轉染Jurkat 細胞組；供體T細胞組；供體CD147siRNA轉染T細胞組；供體中性粒細胞組和供體CD147siRNA轉染中性粒細胞組。移植

76、后第6周再次對皮損進行臨床積分評價并作前后比較，處死SCID鼠，將移植皮損行石蠟包埋，切片。組織學分析包括：表皮厚度；角化不全發(fā)生情況；表皮中上層中性粒細胞聚集和Munro微膿瘍形成情況；真皮淺層血管周圍單一核炎癥細胞浸潤情況，并進行Ki-67（反映角質(zhì)形成細胞增殖情況）、CD3(T細胞標記)和CD15(中性粒細胞標記)的免疫組化檢測。</p><p><b>　　3.2 技術路線</b>&

77、lt;/p><p><b>　　3.3 可行性分析</b></p><p>　　我校三家附屬醫(yī)院皮膚科每年超過20萬患者的門診量可以為本研究的標本來源提供可靠的保證。</p><p>　　項目申請者于1998年開始會同日本鹿兒島大學皮膚科金藏拓郎副教授（Basigin/CD147分子的發(fā)現(xiàn)者之一）在國際上率先開展了CD147在正常皮膚及皮膚腫瘤中作

78、用及機制的系列研究，先后獲得包括兩項國家自然科學基金在內(nèi)的多項國內(nèi)外科研課題資助，取得了五個創(chuàng)新性的科研成績，在國內(nèi)外發(fā)表相關論文10篇（其中SCI論文3篇）(詳見工作基礎和申請人簡歷)。本項目組的主要成員都曾先后參加過以上工作，為本研究的開展奠定了堅實的人員、理論基礎和實驗操作經(jīng)驗。</p><p>　　本項目主要涉及的細胞生物學實驗，siRNA技術和人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型均為世界公認的成熟技術，沒有

79、過高的技術難度。本項目組已成功構建人CD147 siRNA 表達載體并已鑒定了CD147siRNA轉染的有效性，從而為本項目的順利開展奠定了堅實的技術基礎(詳見工作基礎和申請人簡歷)。我們的RT-PCR預實驗發(fā)現(xiàn)，在3例尋常型銀屑病患者和1例膿皰型銀屑病患者外周血T細胞中均有CD147和CyPA的增高表達(詳見工作基礎)。本項目組有開展裸鼠實驗的成功經(jīng)驗（國家自然科學基金，30200248），SCID鼠已先期從中科院上海實驗動物中心購進

80、五只，并已準備開始建立人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型的預實驗。</p><p>　　本項目細胞生物學和分子生物學實驗將在我校腫瘤學衛(wèi)生部重點實驗室、國家遺傳學重點實驗室及鹿大醫(yī)學部皮膚科實驗室開展。以上三家實驗室的技術力量及實驗條件均已達到國內(nèi)乃至國際先進水平。為確保本項目順利開展，本課題組成員（顏克香）將于今年下半年以共同培養(yǎng)博士生身份，由鹿大皮膚科邀請赴日開展本項目的預備實驗。課題實施期間，雙方人員將依據(jù)近

81、八年合作的慣例，定期互訪，交流實驗進展情況并開展討論。</p><p>　　基于以上所述，我們認為本項目在實驗材料、人員、理論和具體操作等方面有相當扎實的基礎，科研構思充分體現(xiàn)了科研工作的延續(xù)性，準備充分，是切實可行的。</p><p>　　4、本項目的特色與創(chuàng)新之處。</p><p>　　經(jīng)檢索1990年以來文獻證實，本項目∶</p><p&g

82、t;　?。?）在國內(nèi)外首次將CD147分子引入銀屑病的科研領域；并首次探討CD147分子與其配體CyPA和CyPB在銀屑病發(fā)病諸多環(huán)節(jié)的作用機制及其相互關系。</p><p>　?。?）在國內(nèi)外首次運用CD147siRNA技術研究該分子在人活體細胞（T細胞和中性粒細胞）中的作用機制。</p><p>　?。?）在國內(nèi)首次建立人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型這一銀屑病實驗動物模型。</

83、p><p>　　5、年度研究計劃及預期研究結果。</p><p>　　5.1 年度研究計劃</p><p>　　2006年1月至2006年12月：</p><p>　　收集病例及臨床資料，石蠟標本制作。HE染色，明確病例診斷、分型和疾病嚴重程度判斷。完成免疫組化實驗及結果觀察、分析。整理資料，完成論文1篇。完成免疫印跡和RT-PCR方法檢測CD1

84、47、CyPA和CyPB表達水平的預實驗，初步構建pSUPER/CD147 siRNA質(zhì)粒。</p><p>　　2007年1月至2007年12月：</p><p>　　完成pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒轉染細胞實驗并鑒定干擾效果。觀察CD147 siRNA對T細胞增殖、活化及基質(zhì)黏附作用的影響，以及對由CyPA和CyPB介導的中性粒細胞趨化性的影響。整理資料，完成論文2-3篇。完

85、成銀屑病實驗動物模型建立的預實驗。參加國際學術會議一次，中日研究人員互訪一次，交流研究成果，商討下一步實驗方案。</p><p>　　2008年1月至2008年6月： </p><p>　　完成動物實驗內(nèi)容及組織學和免疫組化分析。</p><p>　　2008年7月至2008年12月：</p><p>　　整理全部資料，再完成論文2篇，完成結

86、題總結報告并準備申報科研成果。</p><p>　　5.2 預期研究結果</p><p>　　1．完成論文5-6篇，其中1-2篇有望發(fā)表于國外知名皮膚病學雜志；</p><p>　　2．明確CD147分子在銀屑病T細胞活化和基質(zhì)黏附以及中性粒細胞趨化等重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機制；</p><p>　　3．明確CD147 siRNA對人銀屑病皮

87、損-SCID鼠移植模型的效應；</p><p>　　4．為探尋銀屑病新的科研領域和治療方法提供原創(chuàng)性的實驗基礎和理想的靶分子； </p><p>　　5．培養(yǎng)皮膚科專業(yè)博士畢業(yè)生1-2名，碩士畢業(yè)生2-3名；</p><p>　　6．總結實驗結果，申報科研成果。</p><p>　?。ǘ┭芯炕A與工作條件</p><p&

88、gt;<b>　　1、工作基礎</b></p><p>　　Basigin/CD147分子于1990年由本項目的主要參與者，鹿大皮膚科金藏拓郎副教授首次克隆成功。本項目的申請者于1997年赴鹿大皮膚科攻讀博士學位，并與金藏拓郎副教授一起首次將CD147分子引入皮膚科科研領域。在日留學期間及回國工作后，申請者一直在日本皮膚科國際學術交流基金和中國國家自然科學基金（30040028，302002

89、48）等項目的資助下，堅持開展了CD147在正常皮膚及皮膚腫瘤中作用及機制的系列研究，研究內(nèi)容曾先后于七次國際會議交流9次（JIMRO International Symposium on CD147, 1998，日本; JSID 24th Annual Meeting, 1999，日本; JSID 25th Annual Meeting, 2000，日本; CEMSJ 32th Annual Meeting, 2000, 日本;

90、 第100次日本皮膚科學會, 2001; 62nd Annual Meeting of SID, 2001, 美國；The 7th China-Japan Joint Meeting of Dermatology，中國）。</p><p>　　申請者有關CD147的系列研究的主要創(chuàng)新點為(參考文獻詳見申請人簡歷)：1. 在國際上率先證實了Basigin/CD147分子與生理和病理狀態(tài)下角質(zhì)形成細胞分化狀態(tài)相關

91、;2. 在國際上率先證實了Basigin/CD147分子在細胞膜上的超微分布特點;3. 首次明確了Basigin/CD147分子在皮膚腫瘤浸潤和轉移過程中的分子機制。4. 首次提出了皮膚基底細胞癌可能來源于早期胚胎表皮基底細胞的新理論。5. 率先制備了人CD147分子基因的真核表達載體及siRNA 表達載體。</p><p>　　以本項目以上兩名成員為主的實驗組是迄今為止世界上唯一開展CD147分子在皮膚科領域相

92、關研究的工作群體，多年來一直與發(fā)現(xiàn)CD147另一人源同源分子EMMPRIN的美國Biswas實驗室保持著良好的合作關系，近年來項目申請者還先后應邀幫助美國Martin實驗室和法國Daniel實驗室建立與CD147分子有關的科研體系。因此，已在此領域擁有了相當?shù)膰H知名度和導向力。</p><p>　　考慮到RNA干擾技術在近兩年來逐漸成熟，作為一種逆向干預措施，在許多方面相對反義寡核苷酸技術更有優(yōu)勢，為更好地完成

93、在研國家自然科學基金（30200248），我們已成功構建和鑒定了CD147 siRNA 表達載體并證實其轉染能有效抑制黑色素瘤細胞中CD147的表達（詳見下圖），以替代原擬采用的反義寡核苷酸轉染技術。這也為本申請項目的順利完成奠定了堅實的實驗基礎。</p><p>　　1 2 3 4 5 6</p><p>　　圖１　重組質(zhì)粒pSUPER/CD147siRNA酶切鑒

94、定圖</p><p><b>　?。保篗arker </b></p><p>　?。玻褐亟M質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　　３：BglⅡ單酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　?。矗篐ind Ⅲ單酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p>

95、<p>　?。担篐ind Ⅲ 和 BglⅡ雙酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　　６：Hind Ⅲ 和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　　1 2 3 4 5 6</p><p>　　圖2 RT-PCR檢測黑色素瘤細胞（A37

96、5）中CD147的表達 </p><p><b>　　1：Marker</b></p><p>　　2：未轉染黑色素瘤細胞（CD147：692bp; β肌動蛋白：450bp）</p><p>　　3：空白質(zhì)粒pSUPER轉染黑色素瘤細胞</p><p>　　4：重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA(seq1)轉

97、染黑色素瘤細胞</p><p>　　5：未轉染黑色素瘤細胞</p><p>　　6：重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA(seq2)轉染黑色素瘤細胞</p><p>　　為進一步明確本項目的可行性，我們通過RT-PCR預實驗檢測了3例尋常型銀屑病患者、1例膿皰型銀屑病患者和2名健康人外周血T細胞中CD147和CyPA的表達水平，結果顯示：銀屑病患者外周血T細

98、胞中CD147和CyPA的表達水平較健康人顯著增高。</p><p>　　1 2 3 4 5 </p><p>　　圖5 RT-PCR檢測銀屑病患者和健康人外周血T細胞中CD147和CyPA表達</p><p><b>　　1：Marker</b></p><p>　　

99、2：健康人外周血T細胞中CyPA表達</p><p>　　3：銀屑病患者外周血T細胞中CyPA表達</p><p>　　4：銀屑病患者外周血T細胞中CD147表達</p><p>　　5：健康人外周血T細胞中CD147表達</p><p><b>　　2、工作條件</b></p><p>　　本科

100、室實驗室已具備本項目免疫組化及細胞培養(yǎng)所需的實驗條件和設備∶切片機，普通顯微鏡，普通及深低溫冰箱，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱等。</p><p>　　本項目的細胞生物學及分子生物學實驗將在我校腫瘤學衛(wèi)生部重點實驗室、醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室及鹿大醫(yī)學部皮膚科實驗室開展。以上三處均系開放型實驗室，具有先進、齊備的細胞生物學及分子生物學實驗條件。</p><p>　　本項目的動物實驗將在我校設施

101、完備的醫(yī)學動物實驗中心開展。</p><p>　　因此，本項目所需的實驗條件完備，無需購買大型儀器、設備。</p><p><b>　　3、申請人簡歷</b></p><p>　　4、承擔科研項目情況</p><p>　　項目來源：國家自然科學基金</p><p>　　項目名稱∶惡性黑色素瘤細胞中

102、Basigin/CD147的作用及機制研究</p><p>　　批準號∶ 30200248 負責內(nèi)容：</p><p>　　起止年月：2003年1月 - 2005年12月</p><p>　　目前，該項目的完成情況良好，實驗部分的工作已基本完成。</p><p>　　已發(fā)表論文4篇(詳見工作基礎和申請人簡歷)，其

103、中一篇發(fā)表在腫瘤學領域的國際知名期刊Int J Cancer (IF:4.2)并被SCI收錄的國際英文論文引用20余次;其余3篇中的兩篇發(fā)表于中華皮膚科雜志；接受待發(fā)表論文1篇（中華皮膚科雜志）；投稿論文一篇（Int J Cancer）。</p><p>　　迄今已有五名研究生直接參入本項目實驗，并已培養(yǎng)兩名碩士研究生畢業(yè)。</p><p>　　依據(jù)本項目和已完成國家自然科學基金項目（30

104、040028）的實驗結果，我們已申報“Basigin在正常皮膚及皮膚腫瘤中的作用及機制研究”科技成果，并通過湖南省衛(wèi)生廳組織的成果鑒定（見附件2），在9位國內(nèi)同行專家的函審意見中：2位認為達到國際領先水平，7位認為達到國際先進水平。目前正在逐級申報科技獎。</p><p>　　在研項目側重于闡明Basigin/CD147在惡性黑色素瘤中可能的作用和分子機制（黑色素瘤細胞膜上增高表達的CD147分子通過刺激腫瘤細胞

105、周圍成纖維細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶，進而促進腫瘤細胞的浸潤、復發(fā)和轉移），其研究成果是本申請項目的基礎，本申請項目是在研項目的原創(chuàng)性延伸和發(fā)展，兩者無內(nèi)容重復。</p><p>　　5、完成自然科學基金項目情況</p><p>　　項目名稱∶Basigin在皮膚鱗狀細胞癌中的表達、超微定位及意義</p><p>　　批準號∶ 30040028 負責人：

106、</p><p>　　起止年月2000年9月 - 2001年9月</p><p>　　該項目已在預定時間內(nèi)完成了全部預期計劃。為提高相關理論的系統(tǒng)性和全面性，我們還通過科學地利用有限的科研經(jīng)費和爭取國際合作的多種途徑，增加了有關Basigin/CD147在正常皮膚和BCC中表達和意義及皮膚SCC轉移灶中MMPs和CD147表達和意義等科研內(nèi)容。研究成果先后五次于日本研究皮膚科學會，日本臨床

107、電子顯微鏡學會，日本皮膚科學會和美國研究皮膚科學會等世界知名的國際學術會議七篇發(fā)表（口頭報告三次，學術展示四次）；超過原計劃（二篇），發(fā)表學術論文五篇，其中兩篇分別發(fā)表于被SCI收錄的J Cutaneous Pathology（影響因子為1.6）和Histochemistry and Cell Biology（影響因子為1.8）發(fā)表?；谝陨铣煽儯椖控撠熑擞?001年9月被日本研究皮膚科學會授于“外籍皮膚科科學家”獎。</p&g