角蛋白17(K17)作為自身抗原在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、銀屑病是一種常見的，易反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性皮膚病，是Th1/Th17細(xì)胞共同介導(dǎo)的自身免疫紊亂。白介素17(IL-17)是輔助性T細(xì)胞亞群之一Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，在銀屑病的發(fā)病中占有重要的地位，它和IFN-γ都被認(rèn)為是“銀屑病的關(guān)鍵細(xì)胞因子”。IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制包括3條途徑：JAK/STAT、NF-κB和MAPK，其中，JAK/STAT與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）關(guān)系密切。角蛋白17（K17）是“銀屑病相關(guān)性細(xì)胞角蛋白”

2、，與鏈球菌M蛋白具有相同的序列ALEEAN，可特異刺激銀屑病T細(xì)胞，使之活化、釋放IFN-γ等炎癥因子，而IFN-γ又能夠經(jīng)STAT1信號通路上調(diào)K17的表達(dá)，使機(jī)體產(chǎn)生針對K17的自身免疫反應(yīng)，從而形成了一個(gè)惡性環(huán)路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和KC異常增生等病理改變，成為銀屑病發(fā)病過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因K17在銀屑病皮損的高表達(dá)以及其具有刺激T細(xì)胞活化的作用，被界定為銀屑病自身反應(yīng)性T細(xì)胞識別的候選靶抗原。我們以往的研究已經(jīng)證明在銀屑病的病理過程中

3、存在“K17—T細(xì)胞─細(xì)胞因子環(huán)路”，該環(huán)路可能是銀屑病皮損持續(xù)存在和反復(fù)發(fā)作的重要基礎(chǔ)。
　　本研究在此基礎(chǔ)上首次提出并驗(yàn)證IL-17是該環(huán)路中的重要細(xì)胞因子成員，觀察IL-17誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)表達(dá)K17的作用及其調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)一步深入探討K17作為自身抗原在銀屑病發(fā)病過程中的意義，從而加深對銀屑病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識，并為銀屑病的治療提供新的思路。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下：
　　1）使用DMEM/

4、10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞；
　　2）以10U/mL、50U/mL、250U/mL和500U/mL的IL-17分別作用于培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，以IFN-γ處理的HaCaT細(xì)胞為陽性對照，不施加任何干預(yù)的HaCaT細(xì)胞作為空白對照。培養(yǎng)24～72小時(shí)后收獲細(xì)胞，并分別提取RNA和蛋白質(zhì)用于K17表達(dá)水平的檢測；
　　3）用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、ELISA、Westernblot、共聚焦免疫熒光等方法從mRNA和蛋

5、白水平測定K17的表達(dá)水平，篩選IL-17誘導(dǎo)K17表達(dá)的最佳濃度，觀察是否呈劑量依賴關(guān)系；
　　4）以篩選得出的最佳濃度的IL-17處理培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞；
　　5）用抗STAT1和STAT3及各自的磷酸化產(chǎn)物的抗體與HaCaT細(xì)胞共同孵育，ELISA、Westernblot、免疫熒光方法篩選在HaCaT細(xì)胞表達(dá)的信號分子；
　　6）未處理的HaCaT細(xì)胞分別加入相應(yīng)的信號分子抑制劑Fludarabine和Pice

6、atannol孵育2小時(shí)，再加入IL-17培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，12～24小時(shí)后利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、ELISA、Westernblot、免疫熒光等方法觀察信號分子抑制劑各自對IL-17誘導(dǎo)K17表達(dá)的影響；
　　研究結(jié)果：IL-17以劑量依賴的方式誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17，其調(diào)控K17表達(dá)的機(jī)制是經(jīng)STAT1和STAT3兩個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)了調(diào)控K17表達(dá)的一個(gè)新的通路——IL-17