天然抗角蛋白自身抗體在病理性自身免疫中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、正常機(jī)體內(nèi)廣泛存在并具有重要的功能，以往的觀點(diǎn)認(rèn)為其對(duì)AID的發(fā)生具有保護(hù)作用，特別是利用分泌型IgM缺陷小鼠進(jìn)行的研究提示NAA在清除凋亡細(xì)胞、抑制AID的發(fā)生中具有重要作用。另一方面，有研究認(rèn)為NAA也可能因?yàn)榈味?、親和力、特異性等的改變參與了自身免疫病的發(fā)生，并加速自身免疫病的進(jìn)程。目前，關(guān)于NAA 和病理性自身抗體的區(qū)別以及NAA在病理性自身免疫中的作用是免疫學(xué)及相關(guān)學(xué)科關(guān)注的熱點(diǎn)之一。 利用已建立的天然抗角蛋白自身抗體

2、轉(zhuǎn)基因小鼠(anti-keratin autoantibody，AK auto Ab)，對(duì)AK auto Ab的病理意義進(jìn)行了初步分析。本研究組對(duì)NAA家族之一的AK auto Ab進(jìn)行了多年細(xì)致、深入地研究，明確了AK auto Ab的諸多特性。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用未免疫小鼠B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，成功篩選到了分泌AK auto Ab的雜交瘤3B4；在隨后的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)3B4由未突變的胚系基因編碼，具有廣泛的多反應(yīng)性，符合NAA的特性；通

3、過(guò)克隆AK auto Ab的可變區(qū)基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因（Tg）小鼠，為進(jìn)一步研究NAA的產(chǎn)生機(jī)制、功能意義等問(wèn)題提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。我們共獲得了3系具有較高血清AK auto Ab滴度的Tg小鼠，每系均具有相似的表型。本研究對(duì)常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境下39系20周齡以上小鼠的表型變化進(jìn)行了系統(tǒng)而全面的分析，為闡明NAA可能的病理意義進(jìn)行積極的探索。 一、常規(guī)環(huán)境下AK auto Ab 重鏈Tg小鼠的表型分析 1．AK auto Ab

4、Tg小鼠基因型的鑒定、傳代、篩選和維持根據(jù)本研究小組前期實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物對(duì)小鼠基因型進(jìn)行鑒定。第一對(duì)引物應(yīng)該擴(kuò)增出460bp條帶；而第二對(duì)引物應(yīng)該擴(kuò)增出200bp條帶。實(shí)驗(yàn)證明第二對(duì)引物特異性較強(qiáng)。ELISA法檢測(cè)小鼠血清中的抗角蛋白IgM滴度和總IgM 滴度，最終選擇了抗角蛋白IgM水平顯著增高的39系轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行進(jìn)一步研究。 2．AK auto Ab Tg小鼠的大體表現(xiàn)在20周齡前，Tg小鼠與同窩對(duì)照（WT）小鼠表型無(wú)

5、明顯差別。20周齡以后，Tg小鼠逐漸出現(xiàn)病態(tài)表現(xiàn)：明顯消瘦，頸椎前突，弓背畸形，體毛皺褶，攝食減少，活動(dòng)能力差，生存時(shí)間縮短，體重減輕明顯；脾大，臟器與體重比增大，尤其以雌性小鼠更為常見(jiàn)。 3. AK auto Ab Tg小鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查 ①血常規(guī)和血生化。由尾靜脈和眼球靜脈取血，分別在全自動(dòng)血球分析儀和生化分析儀上檢測(cè)血常規(guī)和血生化。血常規(guī)示Tg小鼠血小板（PLT）計(jì)數(shù)升高，淋巴細(xì)胞絕對(duì)值（LYMF）降低，白細(xì)胞總數(shù)

6、（WBC）降低，中性粒細(xì)胞百分比（GPR）升高，血小板壓積（PCT）增大；血生化示總蛋白(TP)升高，尿素氮(BUN)升高，血糖(GLU)降低，而且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明Tg小鼠出現(xiàn)了腎功能不全，發(fā)生了自身免疫性損傷。 ②抗體重鏈Tg小鼠尿液分析。取小鼠尿液，經(jīng)Bradford法定量后，在SDS-PAGE上進(jìn)行尿蛋白電泳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，尿蛋白含量增高，電泳以混合性蛋白尿?yàn)橹?，其結(jié)果提示腎臟病變主要位于腎小球。 ③

7、抗體重鏈Tg小鼠組織學(xué)檢查。取小鼠的脾、肝、腎、腸、肺、皮膚、骨骼肌、胃、股骨等重要器官組織進(jìn)行切片及相關(guān)染色分析。目前發(fā)現(xiàn)主要病變?cè)谀I臟，Tg小鼠可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，基底膜增厚，毛細(xì)血管內(nèi)微血栓形成，腎小球數(shù)量明顯減少，近曲小管擴(kuò)張，遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞變性，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而WT小鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常。PAS染色顯示基底膜肥厚。免疫熒光示Tg小鼠腎小球內(nèi)可見(jiàn)明顯的IgM類顆粒狀熒光物質(zhì)沉積，主要集中在系膜區(qū)，熒光

8、強(qiáng)度在（++～+++），WT小鼠只能見(jiàn)到微弱的熒光，強(qiáng)度為（?～+）；整個(gè)腎小球內(nèi)未見(jiàn)IgG類物質(zhì)沉積。電鏡發(fā)現(xiàn)Tg小鼠腎小球系膜區(qū)系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增生明顯，足突細(xì)胞廣泛融合，可見(jiàn)變性，基底膜有不規(guī)則增厚，偶見(jiàn)分離和雙軌征。以上結(jié)果提示Tg小鼠可能患有自身免疫性疾病，尤以腎臟病變?yōu)橹亍?二、不同飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)AK auto Ab Tg小鼠B細(xì)胞發(fā)育的影響 1．Tg小鼠轉(zhuǎn)入無(wú)菌區(qū)常規(guī)環(huán)境中經(jīng)鑒定的Tg小鼠，在SPF環(huán)境中行剖

9、宮產(chǎn)術(shù)，其子代在此環(huán)境中飼養(yǎng)、鑒定、傳代以備下一步觀察和分析。 2．AK auto Ab Tg小鼠B細(xì)胞發(fā)育分析取不同飼養(yǎng)環(huán)境中的小鼠的骨髓、脾臟、腹腔和淋巴結(jié)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓中不同發(fā)育階段的B細(xì)胞、脾臟中邊緣帶B（MZ/B）細(xì)胞、濾泡B（Fo/B）細(xì)胞以及未成熟B細(xì)胞、腹腔內(nèi)分泌NAA的CD5+B1細(xì)胞的存在數(shù)量和比例，并進(jìn)一步分析其等位基因排斥及T、B細(xì)胞分布情況。我們未發(fā)現(xiàn)不同飼養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞數(shù)量和比例存在明顯差別，

10、結(jié)果提示環(huán)境因素對(duì)Tg小鼠B細(xì)胞的發(fā)育影響不大。 本實(shí)驗(yàn)分析了在常規(guī)環(huán)境中Tg小鼠的表型變化，比較了不同飼養(yǎng)環(huán)境中的感染因素對(duì)Tg小鼠B細(xì)胞發(fā)育的作用，結(jié)果提示了天然自身抗體的過(guò)度表達(dá)對(duì)機(jī)體多系統(tǒng)、多器官產(chǎn)生重要影響；Tg小鼠有發(fā)生自身免疫性疾病的傾向，其中腎臟病變尤為突出，但它是否為小鼠的致死原因仍需進(jìn)一步的研究和論證。外源感染很可能加速了疾病的進(jìn)程但是對(duì)B細(xì)胞的發(fā)育影響不大。 天然自身抗體(natural autoa

11、ntibodies，NAA)是在沒(méi)有任何抗原免疫的情況下，正常機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)一種或多種自身抗原的抗體，其廣泛存在及其功能意義的闡明表明一種生理性自身免疫機(jī)制的存在。因此，目前把自身免疫分為生理性自身免疫和病理性自身免疫。前者是指自身免疫反應(yīng)在一定限度內(nèi)，不造成機(jī)體損傷和功能障礙，其中NAA是生理性自身免疫的主體，在機(jī)體抗感染、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤監(jiān)視、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持等方面發(fā)揮著積極的作用；后者即自身免疫性疾?。╝utoimmune dise