免疫孕鼠體內抗AT1受體自身抗體被動轉運特性的研究.pdf

1、研究背景：子癇前期是妊娠期特發(fā)疾患，病因復雜，病情嚴重，是困擾婦產界的一道難題。后代發(fā)育受累是子癇前期的重大危害之一。研究表明，子癇前期患者的后代出現宮內發(fā)育受限、低/高出生體重、早產等不良事件的機率明顯高于正常孕婦后代，嚴重影響了早期生存質量。盡管如此，除了母體病變、胎盤功能障礙、提早娩出等可能的間接因素外，子癇前期患者后代健康受損的具體機制并不明確。 1999年，Wallukat等首次報道，在子癇前期患者體內存在抗血管緊張素

2、Ⅱ1型受體的自身抗體(AngiotensinⅡ type1 Receptor Autoantibodies，AT1-AA)，該抗體特異性識別AT1受體的細胞外第二環(huán)功能表位肽段(AT1R-ECⅡ)，具有AT1受體類激動劑樣效應，可誘發(fā)平滑肌細胞表達組織因子，滋養(yǎng)層細胞生成NADPH氧化酶，血管收縮等多種病理現象?，F有研究表明，AT1-AA為IgG類免疫球蛋白，而IgG類免疫球蛋白的部分亞類可以由母體被動轉運至后代體內，因此我們推測，母體

3、內的AT1-AA可能會轉給后代，進而影響其生長發(fā)育。為了驗證此假說，本研究利用主動免疫母鼠模型，擬解決以下問題：1)明確母體中的AT1-AA是否具備被動轉運能力；2)抗體的被動轉運有胎盤和乳汁兩條途徑，觀察AT1-AA的被動轉運是通過胎盤和/或乳汁；3)分析母體內AT1-AA屬于何種抗體亞類；4)檢驗母體中的AT1-AA轉運至后代體內后是否仍有活性。以上四個問題的回答將是我們進一步探討AT1-AA影響后代生長發(fā)育的可能機制，以及指導臨床

4、正確進行母嬰保健的重要前提。 目的： 1．明確母鼠體內AT1-AA的被動轉運能力及轉運途徑； 2．鑒定母鼠體內AT1-AA的抗體類及亞類； 3．檢測新生后代鼠體內AT1-AA的活性。 方法： 選取未曾受孕的雌性Wistar大鼠(8周齡，180-200g)和健康雄性Wistar大鼠(220-250g)，將雌鼠分為免疫組和對照組。商業(yè)合成人AT1R-ECⅡ肽段(165-191，I-H-R-N-

5、V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T，純度為95％，吉爾生化)，以此為抗原主動免疫免疫組雌鼠，2周一次，使其產生AT1-AA。待免疫雌鼠體內抗體濃度達高峰后，將其與正常雄鼠(未免疫)交配，以發(fā)現陰栓為懷孕第0天。雌鼠合籠后，每4周加強免疫一次。對照組雌鼠只給予相應的抗原佐劑，其余同免疫組。(1)兩組母鼠正常分娩后，于哺乳1周時檢測各自的后代鼠體內有無AT1-AA；(2)同樣的免疫孕鼠模型

6、，孕20天時，孕鼠行剖宮術，留取胎鼠血清并固定胎盤，ELISA及免疫組化法檢測其中有無AT1-AA。(3)在哺乳期，由乳鼠胃內收集母鼠乳汁，ELISA法檢測其中AT1-AA的分布，并對調同日內生產的免疫組和對照組雌性(或雄性)乳鼠，同胎的雄性(或雌性)乳鼠正常哺乳作為參照，比較各組乳鼠血清中AT1-AA的含量。(4)ELISA法鑒定AT1-AA的免疫球蛋白類及亞類。(5)親和柱提純哺乳1周時后代鼠體內的總IgGs，利用離體灌流技術和大/

7、微血管環(huán)技術，觀察抗體對離體心臟和血管功能活動的影響及作用途徑。(6)根據試劑盒說明，檢測哺乳1周時兩組乳鼠血清中內皮素-1(Endothelin-1，ET-1)的含量。 結果： 1．AT1-AA陽性的免疫雌鼠模型建立 為了研究AT1-AA的被動轉運特點，本研究采用主動免疫法建立AT1-AA陽性的孕鼠模型。ELISA檢測顯示，待孕的雌性Wistar大鼠于初次免疫后2周，血清中已有AT1-AA出現，并且滴度迅速升高

8、，在8周時達高峰(OD值為2.76±0.07 vs．0.43±0.05，P＜0.01，vs．同期對照組，圖1a)，同期對照組則無AT1-AA產生。而且，免疫鼠生成的AT1-AA屬于IgG類免疫球蛋白(圖1a)而非IgM類及IgA類(圖1b，1c)，同患者體內的抗體一致，表明主動免疫成功。 2．母鼠中的AT1-AA可被動轉運給后代 為了首先明確免疫母鼠體內的AT1-AA能否轉運給胎兒，ELISA法檢測了哺乳1周時兩組后代鼠

9、體內的抗體。結果發(fā)現，AT1-AA陽性的免疫組母鼠所產后代，于檢測時血清中該抗體顯著陽性(n=8)，P/N值大于2.1(OD值為1.49±0.25)，而對照組胎鼠血清中則無該抗體(n=9)，P/N值小于1.5(OD值為0.13±0.03)，兩者相比P＜0.01(圖2)。 3．AT1-AA可通過大鼠胎盤 為了單獨觀察AT1-AA的胎盤轉運途徑，利用同樣的動物模型，ELISA法檢測臨產時(孕20天)胎鼠血清，發(fā)現AT1-AA

10、陽性的免疫組孕鼠，其宮內胎鼠血清中AT1-AA的含量(n=12，OD值為2.32±0.35)顯著高于對照組胎鼠(n=12，OD值為0.13±0.04)，兩者相比P＜0.01(圖3a)。為了直接追蹤AT1-AA在胎盤中的轉運路線，本研究又采用免疫組織化學法對兩組胎盤進行染色，結果顯示，在免疫鼠胎盤絨毛的滋養(yǎng)層細胞及血管內皮細胞處均有明顯黃染(圖3b)，證明有AT1-AA表達，而陰性對照組胎盤中卻無特異性AT1-AA存在(圖3b)。

11、 4．乳汁是AT1-AA被動轉運的另一重要途徑 哺乳1周時，由免疫組乳鼠胃內得到的母鼠乳汁，其AT1-AA水平(n=10，OD值為1.33±0.26)明顯高于陰性對照組(n=10，OD值為0.19±0.10)，，計算得P/N值大于2.1，即AT1-AA為陽性(圖4a)。為排除乳鼠胃內的乳汁受多種因素干擾，本研究又設計了交叉喂養(yǎng)實驗。ELISA檢測顯示，7天時，由免疫組母鼠代喂的對照組雌性乳鼠體內出現了AT1-AA(OD值為2.6

12、0±0.0.12 vs．0.16±0.07，P＜0.01，vs．對照組雄性乳鼠，圖4b)，而由對照組母鼠代喂的免疫組雌性乳鼠體內AT1-AA水平比其同胎雄性后代的明顯下降(OD值為1.04±0.26 vs．2.62±0.08，P＜0.15，vs．免疫組雄性乳鼠，圖4b)。 5．免役鼠中AT1-AA的IgG亞類鑒定 親和柱純化免疫大鼠抗血清后，得到以AT1-AA為主要成分的總IgGs，SDS-PAGE純度檢測顯示，在55K

13、Da和25KDa附近出現清晰的兩條帶，分別代表IgG的重鏈和輕鏈(圖5a)。然后，EIASA法對該純化抗體的IgG亞類鑒定結果證明，免疫鼠中的AT1-AA主要屬于IgG2b，僅小部分屬于IgG2a(圖5b)。 6．后代鼠中的IgGs增強離體大鼠心臟功能 免疫組乳鼠血清中的IgGs(0.1μmol/L)可引起離體灌流的大鼠左室發(fā)展壓(INDP)，左室壓最大上升速率(+dp/dtmax)及左室壓最大下降速率(-dp/dtma

14、x)明顯升高，與空白對照組相比，均具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)。該效應與AT1受體的激動劑angiotensinⅡ相類似，且此兩者的作用均可被AT1受體阻斷劑losartan明顯阻斷，而即便1μmol/L的免疫對照組IgGs對離體心功能也沒有影響(表1)。 7．后代鼠中的IgGs引起離體大鼠胸主動脈環(huán)收縮 同Table1結果相一致，0.1μmol/L免疫組乳鼠血清中的IgGs和angiote

15、nsinⅡ均可引起大鼠主動脈血管環(huán)明顯收縮(收縮幅度分別為0.44±0.05g，0.52±0.07g)，與空白對照組有顯著性差異(P＜0.01)。1μmol/L的losartan可有效阻斷抗體效應(0.05±0.02g，P＜0.01，vs．免疫組IgGs)，而免疫對照組IgGs則對離體血管環(huán)幾乎無影響(圖6)。 8．后代鼠體內ET-1含量升高 ET-1是反映內皮損傷的重要指標之一。血清檢測發(fā)現，哺乳1周時，AT1-AA