免疫孕鼠體內(nèi)抗AT1受體自身抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)特性的研究.pdf

1、研究背景：子癇前期是妊娠期特發(fā)疾患，病因復(fù)雜，病情嚴(yán)重，是困擾婦產(chǎn)界的一道難題。后代發(fā)育受累是子癇前期的重大危害之一。研究表明，子癇前期患者的后代出現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育受限、低/高出生體重、早產(chǎn)等不良事件的機(jī)率明顯高于正常孕婦后代，嚴(yán)重影響了早期生存質(zhì)量。盡管如此，除了母體病變、胎盤功能障礙、提早娩出等可能的間接因素外，子癇前期患者后代健康受損的具體機(jī)制并不明確。 1999年，Wallukat等首次報(bào)道，在子癇前期患者體內(nèi)存在抗血管緊張素

2、Ⅱ1型受體的自身抗體(AngiotensinⅡ type1 Receptor Autoantibodies，AT1-AA)，該抗體特異性識(shí)別AT1受體的細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(AT1R-ECⅡ)，具有AT1受體類激動(dòng)劑樣效應(yīng)，可誘發(fā)平滑肌細(xì)胞表達(dá)組織因子，滋養(yǎng)層細(xì)胞生成NADPH氧化酶，血管收縮等多種病理現(xiàn)象?，F(xiàn)有研究表明，AT1-AA為IgG類免疫球蛋白，而IgG類免疫球蛋白的部分亞類可以由母體被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至后代體內(nèi)，因此我們推測(cè)，母體

3、內(nèi)的AT1-AA可能會(huì)轉(zhuǎn)給后代，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)發(fā)育。為了驗(yàn)證此假說，本研究利用主動(dòng)免疫母鼠模型，擬解決以下問題：1)明確母體中的AT1-AA是否具備被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力；2)抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)有胎盤和乳汁兩條途徑，觀察AT1-AA的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是通過胎盤和/或乳汁；3)分析母體內(nèi)AT1-AA屬于何種抗體亞類；4)檢驗(yàn)?zāi)阁w中的AT1-AA轉(zhuǎn)運(yùn)至后代體內(nèi)后是否仍有活性。以上四個(gè)問題的回答將是我們進(jìn)一步探討AT1-AA影響后代生長(zhǎng)發(fā)育的可能機(jī)制，以及指導(dǎo)臨床

4、正確進(jìn)行母嬰保健的重要前提。 目的： 1．明確母鼠體內(nèi)AT1-AA的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑； 2．鑒定母鼠體內(nèi)AT1-AA的抗體類及亞類； 3．檢測(cè)新生后代鼠體內(nèi)AT1-AA的活性。 方法： 選取未曾受孕的雌性Wistar大鼠(8周齡，180-200g)和健康雄性Wistar大鼠(220-250g)，將雌鼠分為免疫組和對(duì)照組。商業(yè)合成人AT1R-ECⅡ肽段(165-191，I-H-R-N-

5、V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T，純度為95％，吉爾生化)，以此為抗原主動(dòng)免疫免疫組雌鼠，2周一次，使其產(chǎn)生AT1-AA。待免疫雌鼠體內(nèi)抗體濃度達(dá)高峰后，將其與正常雄鼠(未免疫)交配，以發(fā)現(xiàn)陰栓為懷孕第0天。雌鼠合籠后，每4周加強(qiáng)免疫一次。對(duì)照組雌鼠只給予相應(yīng)的抗原佐劑，其余同免疫組。(1)兩組母鼠正常分娩后，于哺乳1周時(shí)檢測(cè)各自的后代鼠體內(nèi)有無AT1-AA；(2)同樣的免疫孕鼠模型

6、，孕20天時(shí)，孕鼠行剖宮術(shù)，留取胎鼠血清并固定胎盤，ELISA及免疫組化法檢測(cè)其中有無AT1-AA。(3)在哺乳期，由乳鼠胃內(nèi)收集母鼠乳汁，ELISA法檢測(cè)其中AT1-AA的分布，并對(duì)調(diào)同日內(nèi)生產(chǎn)的免疫組和對(duì)照組雌性(或雄性)乳鼠，同胎的雄性(或雌性)乳鼠正常哺乳作為參照，比較各組乳鼠血清中AT1-AA的含量。(4)ELISA法鑒定AT1-AA的免疫球蛋白類及亞類。(5)親和柱提純哺乳1周時(shí)后代鼠體內(nèi)的總IgGs，利用離體灌流技術(shù)和大/

7、微血管環(huán)技術(shù)，觀察抗體對(duì)離體心臟和血管功能活動(dòng)的影響及作用途徑。(6)根據(jù)試劑盒說明，檢測(cè)哺乳1周時(shí)兩組乳鼠血清中內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)的含量。 結(jié)果： 1．AT1-AA陽性的免疫雌鼠模型建立 為了研究AT1-AA的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)，本研究采用主動(dòng)免疫法建立AT1-AA陽性的孕鼠模型。ELISA檢測(cè)顯示，待孕的雌性Wistar大鼠于初次免疫后2周，血清中已有AT1-AA出現(xiàn)，并且滴度迅速升高

8、，在8周時(shí)達(dá)高峰(OD值為2.76±0.07 vs．0.43±0.05，P＜0.01，vs．同期對(duì)照組，圖1a)，同期對(duì)照組則無AT1-AA產(chǎn)生。而且，免疫鼠生成的AT1-AA屬于IgG類免疫球蛋白(圖1a)而非IgM類及IgA類(圖1b，1c)，同患者體內(nèi)的抗體一致，表明主動(dòng)免疫成功。 2．母鼠中的AT1-AA可被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)給后代 為了首先明確免疫母鼠體內(nèi)的AT1-AA能否轉(zhuǎn)運(yùn)給胎兒，ELISA法檢測(cè)了哺乳1周時(shí)兩組后代鼠

9、體內(nèi)的抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AT1-AA陽性的免疫組母鼠所產(chǎn)后代，于檢測(cè)時(shí)血清中該抗體顯著陽性(n=8)，P/N值大于2.1(OD值為1.49±0.25)，而對(duì)照組胎鼠血清中則無該抗體(n=9)，P/N值小于1.5(OD值為0.13±0.03)，兩者相比P＜0.01(圖2)。 3．AT1-AA可通過大鼠胎盤 為了單獨(dú)觀察AT1-AA的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，利用同樣的動(dòng)物模型，ELISA法檢測(cè)臨產(chǎn)時(shí)(孕20天)胎鼠血清，發(fā)現(xiàn)AT1-AA

10、陽性的免疫組孕鼠，其宮內(nèi)胎鼠血清中AT1-AA的含量(n=12，OD值為2.32±0.35)顯著高于對(duì)照組胎鼠(n=12，OD值為0.13±0.04)，兩者相比P＜0.01(圖3a)。為了直接追蹤AT1-AA在胎盤中的轉(zhuǎn)運(yùn)路線，本研究又采用免疫組織化學(xué)法對(duì)兩組胎盤進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，在免疫鼠胎盤絨毛的滋養(yǎng)層細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞處均有明顯黃染(圖3b)，證明有AT1-AA表達(dá)，而陰性對(duì)照組胎盤中卻無特異性AT1-AA存在(圖3b)。

11、 4．乳汁是AT1-AA被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的另一重要途徑 哺乳1周時(shí)，由免疫組乳鼠胃內(nèi)得到的母鼠乳汁，其AT1-AA水平(n=10，OD值為1.33±0.26)明顯高于陰性對(duì)照組(n=10，OD值為0.19±0.10)，，計(jì)算得P/N值大于2.1，即AT1-AA為陽性(圖4a)。為排除乳鼠胃內(nèi)的乳汁受多種因素干擾，本研究又設(shè)計(jì)了交叉喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。ELISA檢測(cè)顯示，7天時(shí)，由免疫組母鼠代喂的對(duì)照組雌性乳鼠體內(nèi)出現(xiàn)了AT1-AA(OD值為2.6

12、0±0.0.12 vs．0.16±0.07，P＜0.01，vs．對(duì)照組雄性乳鼠，圖4b)，而由對(duì)照組母鼠代喂的免疫組雌性乳鼠體內(nèi)AT1-AA水平比其同胎雄性后代的明顯下降(OD值為1.04±0.26 vs．2.62±0.08，P＜0.15，vs．免疫組雄性乳鼠，圖4b)。 5．免役鼠中AT1-AA的IgG亞類鑒定 親和柱純化免疫大鼠抗血清后，得到以AT1-AA為主要成分的總IgGs，SDS-PAGE純度檢測(cè)顯示，在55K

13、Da和25KDa附近出現(xiàn)清晰的兩條帶，分別代表IgG的重鏈和輕鏈(圖5a)。然后，EIASA法對(duì)該純化抗體的IgG亞類鑒定結(jié)果證明，免疫鼠中的AT1-AA主要屬于IgG2b，僅小部分屬于IgG2a(圖5b)。 6．后代鼠中的IgGs增強(qiáng)離體大鼠心臟功能 免疫組乳鼠血清中的IgGs(0.1μmol/L)可引起離體灌流的大鼠左室發(fā)展壓(INDP)，左室壓最大上升速率(+dp/dtmax)及左室壓最大下降速率(-dp/dtma

14、x)明顯升高，與空白對(duì)照組相比，均具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)。該效應(yīng)與AT1受體的激動(dòng)劑angiotensinⅡ相類似，且此兩者的作用均可被AT1受體阻斷劑losartan明顯阻斷，而即便1μmol/L的免疫對(duì)照組IgGs對(duì)離體心功能也沒有影響(表1)。 7．后代鼠中的IgGs引起離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)收縮 同Table1結(jié)果相一致，0.1μmol/L免疫組乳鼠血清中的IgGs和angiote

15、nsinⅡ均可引起大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)明顯收縮(收縮幅度分別為0.44±0.05g，0.52±0.07g)，與空白對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.01)。1μmol/L的losartan可有效阻斷抗體效應(yīng)(0.05±0.02g，P＜0.01，vs．免疫組IgGs)，而免疫對(duì)照組IgGs則對(duì)離體血管環(huán)幾乎無影響(圖6)。 8．后代鼠體內(nèi)ET-1含量升高 ET-1是反映內(nèi)皮損傷的重要指標(biāo)之一。血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，哺乳1周時(shí)，AT1-AA