副豬嗜血桿菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AT1的功能研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌屬于巴斯德菌科細(xì)小多形態(tài)桿菌,常定殖于健康豬上呼吸道中,但在一定條件下能侵入機(jī)體,引起以多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎為特征的格拉瑟氏病。目前副豬嗜血桿菌已成為嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的細(xì)菌性病原之一,但是對(duì)其致病機(jī)制及毒力因子了解甚少。副豬嗜血桿菌作為上呼吸道常在菌,粘附入侵對(duì)疾病的發(fā)生很重要。一些研究表明自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是副豬嗜血桿菌的潛在毒力因子,且地方分離株SH0165的全基因組測(cè)序完成后預(yù)測(cè)其有4個(gè)自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的開(kāi)放讀碼框,其中一

2、個(gè)為假基因,另外三個(gè)功能基因分別命名為AT1,AT2,AT3。
　　 自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在多種革蘭氏陰性菌中有報(bào)道,是一類(lèi)有特殊結(jié)構(gòu)的細(xì)菌外膜蛋白或者分泌蛋白,其結(jié)構(gòu)主要由三部分組成:N末端可剪切的信號(hào)肽,中間的承載結(jié)構(gòu)域也叫α域,以及C末端的轉(zhuǎn)位單元也叫β域。其中信號(hào)肽介導(dǎo)蛋白跨越內(nèi)膜,轉(zhuǎn)位單元介導(dǎo)承載域跨越外膜。自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有多種生物學(xué)活性,常與細(xì)菌的致病性相關(guān),主要包括粘附、入侵、細(xì)胞毒性、生物被膜形成及血清抗性等。
　　

3、副豬嗜血桿菌的AT1是Va型分泌系統(tǒng)蛋白,其轉(zhuǎn)位單元與百日咳桿菌的Pertactin有27％的同源性。因此,本實(shí)驗(yàn)以AT1為研究對(duì)象,對(duì)其功能進(jìn)行研究。主要包括以下內(nèi)容:
　　 1.at1全長(zhǎng)及at1-pd克隆、測(cè)序
　　 以0165基因組DNA為模板,用引物AT1F/AT1R擴(kuò)增at1全長(zhǎng),用引物AT1PF/AT1PR擴(kuò)增atl-passenger domain(at1-pd)。at1全長(zhǎng)擴(kuò)增片段大小為2577bp,a

4、t1-pd目的片段大小為1566 bp。GeneBank登錄號(hào)為NC011852。2.AT1全長(zhǎng)及AT1-PD原核表達(dá)
　　 分別將at1全長(zhǎng)及at1-pd插入pET-30a和pET-28a原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物表明,AT1全長(zhǎng)表達(dá)在菌體沉淀中,大小約為100 kDa,AT1-PD與His融合表達(dá),大小為85 kDa。不同誘導(dǎo)時(shí)間分析表明,0.8mM

5、IPTG誘導(dǎo)4h蛋白表達(dá)量最高。AT1-PD融合表達(dá)后主要以可溶性蛋白存在,經(jīng)Ni Sepharose TM6 Fast Flow親和層析柱純化。
　　 3.AT1-PD單克隆抗體制備
　　 以純化的AT1-PD為抗原,背部皮下免疫4～6周齡的Balb/c雌性小鼠,每次注射100μg弗氏佐劑乳化的蛋白,兩周一次。融合前腹腔加強(qiáng)免疫100～300μg蛋白,細(xì)胞融合后用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清,經(jīng)過(guò)至少3次有限稀

6、釋法克隆,獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株,腹腔注射小鼠制備腹水。本實(shí)驗(yàn)總共融合兩次,獲得9株雜交瘤細(xì)胞,并分別制備腹水,其中一株單抗腹水效價(jià)達(dá)100×29。隨后通過(guò)Western-blot鑒定單克隆抗體,結(jié)果表明其特異性較好。
　　 4.豬氣管上皮細(xì)胞的制備
　　 本實(shí)驗(yàn)采用未食初乳的乳豬,以鏈酶蛋白酶冷消化法制備豬氣管上皮原代細(xì)胞。原代細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn),傳代后活性降低,最多可傳6代。
　　 5.AT1蛋白的定位
　　

7、 分別提取了工程菌pET-30a-AT1/BL21和副豬嗜血桿菌SH0165的外膜蛋白及分泌蛋白,以抗AT1-PD的單克隆抗體為一抗,通過(guò)Western-blot進(jìn)行蛋白定位。結(jié)果表明,AT1蛋白在工程菌pET-30a-AT1/BL21和SH0165中均位于外膜上。
　　 6.AT1蛋白體外功能研究
　　 以豬肺上皮細(xì)胞(St.Jude porcine lung,SJPL)、豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Pig iliacendo