熱應(yīng)激需求蛋白HtrA在副豬嗜血桿菌應(yīng)激及粘附中的作用研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）為格拉瑟氏病(Gl(a)sser's disease)的病原，為定殖于健康豬上呼吸道的條件致病菌，在某些條件下能夠侵入機(jī)體并引發(fā)豬的多發(fā)性、系統(tǒng)性疾病。熱應(yīng)激需求蛋白(high temperature requirement A) HtrA家族是一類在單細(xì)胞和多細(xì)胞生物中高度保守的蛋白酶，在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過程中極為重要。在許多病原菌當(dāng)中，htrA編碼的熱應(yīng)激需求蛋白與其自身生存及毒

2、力密切相關(guān)。本課題主要研究了副豬嗜血桿菌中HtrA對(duì)于其在應(yīng)激條件下的自身存活及對(duì)宿主細(xì)胞粘附能力的影響，取得的主要結(jié)果如下:
　　1.Nagasaki-ΔhtrA缺失株的構(gòu)建及鑒定
　　構(gòu)建重組質(zhì)粒pK18mobsacB-htrA-UKD自然轉(zhuǎn)化至副豬嗜血桿菌血清5型參考菌株Nagasaki中，并以kan抗性篩選得到htrA缺失突變株Nagasaki-ΔhtrA。通過PCR、RT-PCR、Southern blot等鑒定方

3、法，證明htrA基因缺失株構(gòu)建成功。
　　2.Nagasaki野生株與Nagasaki-Δ htrA缺失株環(huán)境適應(yīng)性比較
　　將Nagasaki與Nagasaki-Δ htrA分別在37℃及40℃培養(yǎng)并繪制生長曲線，結(jié)果表明在37℃及40℃條件下缺失菌株的生長曲線受到不同程度的影響，且40℃時(shí)缺失菌株的生長顯著減緩，活菌數(shù)降低。
　　在pH6.5及pH8.5的條件下培養(yǎng)并繪制生長曲線，結(jié)果表明偏酸性條件下兩株菌的生長曲

4、線均受到顯著影響，而在偏堿性條件下兩株菌的生長曲線受影響程度較小，對(duì)數(shù)期時(shí)同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)缺失株的OD600值低于野生株，證明缺失株環(huán)境適應(yīng)性較野生株弱。掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失株的菌體表面較野生株光滑。
　　3.副豬嗜血桿菌中HtrA與菌株的抗吞噬及粘附能力、血清抗性相關(guān)
　　與豬肺泡巨噬細(xì)胞(3 D4/2)互作后顯示Nagasaki-ΔhtrA抗吞噬能力顯著高于野生菌株。與豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)及豬髖動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(P

5、IEC)互作后顯示Nagasaki-ΔhtrA的粘附指數(shù)在0.5h、1.5h、2.5h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)顯著低于Nagasaki野生株。加入原核表達(dá)的HtrA后Nagasaki野生株對(duì)豬腎上細(xì)胞(PK-15)的粘附能力顯著增強(qiáng)。血清抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，在缺失htrA基因之后Nagasaki的血清抗性顯著提高。
　　4.熒光定量實(shí)驗(yàn)篩選存活、粘附相關(guān)差異表達(dá)基因
　　選出副豬嗜血桿菌與細(xì)菌粘附侵入、熱休克、血清抗性有關(guān)的基因進(jìn)行相對(duì)熒

6、光定量實(shí)驗(yàn)，在37℃條件下，htrA基因的缺失會(huì)顯著下調(diào)rfaE、thyA、cdtB、nanH、rfaF基因的表達(dá)，這些基因與副豬嗜血桿菌的粘附定殖能力相關(guān)，和之前粘附能力顯著下降的表型一致。而較顯著上調(diào)表達(dá)的有opsX基因和clpP基因，分別與血清抗性及熱休克相關(guān);40℃時(shí)htrA基因的缺失所下調(diào)表達(dá)的基因也主要是與粘附相關(guān)，另外兩個(gè)熱休克相關(guān)基因degS、clpP也下調(diào)表達(dá)。證明htrA的缺失影響到了重要相關(guān)功能基因的表達(dá)。