副豬嗜血桿菌細(xì)胞致死膨脹毒素對細(xì)胞和仔豬致病作用研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是一種定植在豬上呼吸道的革蘭氏陰性條件致病菌，是導(dǎo)致保育豬死亡的重要病原菌之一。由于研究起步較晚，人們對其毒力因子及致病機理仍不清楚，這在一定程度制約著對該病的防控。
　　細(xì)胞致死膨脹毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)是發(fā)現(xiàn)的唯一具有DNase活性的AB型細(xì)菌毒素，它能引起DSB(DNA double-strand break)反應(yīng)，導(dǎo)致真

2、核細(xì)胞周期的不可逆阻滯和靶細(xì)胞凋亡，在一些病原菌致病過程中發(fā)揮著重要作用。由于編碼該毒素的基因簇具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，cdt基因很可能是H.parasuis重要的毒力因子，很有必要對其致病作用進行深入的研究。
　　本課題以副豬嗜血桿菌中的cdt為研究對象，通過細(xì)胞實驗和宿主動物實驗從體外和體內(nèi)兩方面水平探究CDT的致病作用。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.自然轉(zhuǎn)化獲得cdt基因缺失株
　　通過PCR的方法擴增得到cdt上

3、下游同源臂，gm或kan抗性盒;將上游同源臂、抗性盒和下游同源臂用重疊PCR的方法重疊拼接后，連接到自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB上得到重組質(zhì)粒pK18-cdt1-UGD和pK18-cdt2-UKD;通過兩次自然轉(zhuǎn)化獲得JS0135Δcdt1∷ gmΔcdt2∷kan，簡稱JS0135Δcdt1Δcdt2。通過PCR、Southern blot、DNA測序等鑒定方法，證明cdt雙拷貝的基因缺失株構(gòu)建成功。
　　2.H.paras

4、uis中的CDT對PK-15細(xì)胞具有毒性作用
　　將不同劑量的野生菌株和cdt缺失菌株分泌蛋白與PK-15細(xì)胞互作，3h后繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h，發(fā)現(xiàn)野生菌株分泌蛋白組可以使PK-15細(xì)胞稀疏，細(xì)胞膨脹，核濃染增大，出現(xiàn)空泡，甚至崩解，并且這種毒性作用具有時間和劑量的依賴性，定性地說明了CDT對PK-15細(xì)胞具有毒性作用。
　　將適當(dāng)菌量的野生菌株和cdt缺失菌株分別與PK-15細(xì)胞互作4h、6h，然后測細(xì)胞的LDH

5、活性，發(fā)現(xiàn)野生菌株組細(xì)胞毒性強于缺失菌株組的細(xì)胞毒性，且差異極顯著，定量地說明了CDT對PK-15細(xì)胞具有毒性作用。
　　3.H.parasuis中的CDT與細(xì)菌的抗吞噬能力相關(guān)
　　將野生菌株和cdt缺失菌株與豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/2互作，發(fā)現(xiàn)野生菌株抵抗3D4/2細(xì)胞的能力比缺失株強，說明H.parasuis中的CDT在細(xì)菌抗吞噬方面具有重要作用。
　　4.H.parasuis中的CDT對仔豬具有一定程度的致病作用