副豬嗜血桿菌細(xì)胞致死膨脹毒素細(xì)胞毒性機(jī)制研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，H.parasuis）是引起副豬嗜血桿菌病的病原，該病主要表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎。細(xì)胞致死膨脹毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)是H.parasuis的重要毒力因子，由CdtA、 CdtB和CdtC3個(gè)亞基組成。為研究副豬嗜血桿菌細(xì)胞致死膨脹毒素(HpCDT)對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用，本研究以豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和PK-15細(xì)胞為模型

2、，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦、免疫印跡、熒光定量PCR等方法進(jìn)行毒素與細(xì)胞的互作研究。
　　通過(guò)Predsi、Signal-Blast和Signal-3L軟件預(yù)測(cè)CdtA，CdtB和CdtC的信號(hào)肽，結(jié)果顯示其信號(hào)肽分別為N端1-19aa、1-21aa和1-19aa。去掉信號(hào)肽后成功地以可溶形式表達(dá)了3種重組蛋白。純化的CdtB在體外能夠剪切環(huán)狀或線性DNA，表明其具有DNase活性;在體內(nèi)純化的CdtB能夠誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞產(chǎn)生

3、γ-H2A.X，說(shuō)明其具有DNase活性，并引起了DNA雙鏈斷裂。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析重組蛋白處理的細(xì)胞周期和凋亡情況，結(jié)果表明單獨(dú)的CdtB能夠引起PAM和PK-15細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，而在CdtA或/和CdtC的幫助下能夠更顯著地增強(qiáng)這種作用。進(jìn)一步研究結(jié)果表明CDT全毒素能夠引起最顯著的細(xì)胞膨脹、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。Pifithrin-α和CDT共同處理PK-15細(xì)胞能夠明顯地抑制其細(xì)胞凋亡，說(shuō)明CDT誘導(dǎo)的凋亡是p53