致病桿菌中SrfABC三元毒素的細(xì)胞毒性及作用機制研究.pdf

1、致病桿菌屬（Xenorhabdus sp.）是一類與斯氏線蟲(Steinernemasp.)互惠共生的昆蟲病原線蟲共生菌，能夠分泌多種具有殺蟲、抑菌和抗腫瘤的活性產(chǎn)物。課題組在前期研究中，構(gòu)建了X.stockiae HN_xs01菌株的Fosmid基因組文庫，從中篩選到了對昆蟲細(xì)胞具有毒性的三元復(fù)合毒素SrfABC。本研究對SrfABC毒素的細(xì)胞毒性及其作用機制進行了研究，為闡明該類毒素在致病桿菌對昆蟲致病中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　

2、　首先，我們利用pMD-srfABC表達載體在大腸桿菌中表達SrfABC毒素蛋白。表達SrfABC毒素的菌體全蛋白對昆蟲中腸細(xì)胞CF203/2.5具有明顯的細(xì)胞毒性:與對照相比，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞表現(xiàn)出皺縮。利用流式細(xì)胞儀檢測，我們發(fā)現(xiàn)含有SrfABC毒素的全蛋白導(dǎo)致CF203/2.5細(xì)胞阻滯在S期。同時，我們將srfABC基因置于阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子(pBAD)下游表達，進一步研究了SrfABC毒素對哺乳動物細(xì)胞HUVEC、HEK

3、293T及B16的細(xì)胞毒性。研究結(jié)果顯示:與對照相比較，經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)后的菌體全蛋白對腫瘤細(xì)胞HEK293T、B16的形態(tài)也具有顯著影響，細(xì)胞呈現(xiàn)變圓、偽足消失、貼壁性降低、數(shù)目減少等現(xiàn)象;而對人類正常細(xì)胞HUVEC基本沒有影響。此外，我們在E.coli BL21(DE3)中單獨表達了SrfA、SrfB、SrfC三種組分，通過SDS-PAGE分離目的蛋白并注射新西蘭兔，分別獲得了SrfA，SrfB，SrfC的多克隆抗體。
　　為了

4、研究SrfABC毒素的作用機制，我們分別構(gòu)建了SrfA，SrfB，SrfC三組分的哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的表達載體，并分別轉(zhuǎn)染至HEK293T、Hela細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞CF203/2.5中。轉(zhuǎn)染實驗表明:SrfA，SrfB，SrfC均在HEK293T、Hela細(xì)胞中得到成功表達，且對兩種細(xì)胞都表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞毒性;相比較SrfB、SrfC蛋白，SrfA蛋白在腫瘤細(xì)胞中表達導(dǎo)致細(xì)胞死亡率最高;經(jīng)凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果表明三組分均能造成PA

5、RP蛋白剪切，推測可能引起細(xì)胞凋亡。利用激光共聚焦顯微鏡觀察到SrfA蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)，并導(dǎo)致線粒體消失，細(xì)胞骨架解聚;SrfB，SrfC蛋白分布于細(xì)胞核，并導(dǎo)致線粒體消失。Western Blot檢測顯示，SrfA蛋白轉(zhuǎn)染入HEK293T和Hela細(xì)胞中都出現(xiàn)一條分子量明顯大于目的產(chǎn)物的條帶，分析可能是SrfA蛋白在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生了翻譯后修飾。然而細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗沒有發(fā)現(xiàn)SrfABC單獨組分對昆蟲細(xì)胞CF203/2.5有毒性，具體原因有待