副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，H.parasuis）是定殖于豬上呼吸道的一種條件致病菌，在應(yīng)激或免疫抑制病原混合感染時(shí)，可引起以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和肺炎為特征的格拉瑟氏?。℅l(a)sser's disease），給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。豬肺泡巨噬細(xì)胞作為天然免疫細(xì)胞的重要組成部分，通過介導(dǎo)吞噬殺傷、產(chǎn)生活性氧及活性氮類來殺傷病原和釋放一些細(xì)胞因子和趨化因子聚集中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞到感染部位發(fā)揮免疫功

2、能。
　　本課題從副豬嗜血桿菌感染宿主肺泡巨噬細(xì)胞的角度，使用RNA-seq技術(shù)，首次對(duì)強(qiáng)弱毒力副豬嗜血桿菌體外感染豬肺泡巨噬細(xì)胞傳代細(xì)胞系3D4/21的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。結(jié)果如下:
　　1.SH0165和HPS1712的抗吞噬能力和誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)的比較
　　將副豬嗜血桿菌SH0165和HPS1712以10個(gè)MOI與豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21互作8h，發(fā)現(xiàn)HPS1712的吞噬率顯著高于SH0165，說明SH0165抗吞

3、噬能力強(qiáng)于HPS1712。將SH0165和HPS1712與3D4/21細(xì)胞互作，然后檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在8h時(shí)SH0165感染組產(chǎn)生IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)水平高于HPS1712感染組。而在12h、24h時(shí)HPS1712感染組IL-1隊(duì)IL-6表達(dá)水平高于SH0165感染組。通過吞噬實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞因子的檢測(cè)，確定SH0165和HPS1712感染劑量為10個(gè)MOI。
　　2.副豬嗜血桿菌感染3D4/2

4、1細(xì)胞差異表達(dá)基因篩選和功能聚類分析
　　本研究采用SH0165，Nagasaki，SW114，HPS1712以10個(gè)MOI體外感染豬傳代肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21，在感染后8h進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示:SH0165，Nagasaki，SW114，HPS1712感染組中分別有542，502，662，37個(gè)差異表達(dá)基因，其中分別包括283，336，359，34個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和259，166，303，3個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，并對(duì)這些差

5、異表達(dá)基因進(jìn)行了功能聚類分析。
　　3.差異表達(dá)基因的生物進(jìn)程和信號(hào)通路富集分析
　　通過對(duì)四組差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋、生物進(jìn)程和信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要與轉(zhuǎn)錄因子，基因表達(dá)，細(xì)胞分化，炎癥反應(yīng)，免疫反應(yīng)，細(xì)胞凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物進(jìn)程有關(guān)，信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn):細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞凋亡、趨化因子信號(hào)通路、NF-kB、p53和MAPK信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等通路聚集程度較

6、高。對(duì)這些差異表達(dá)基因功能和信號(hào)通路富集分析表明機(jī)體通過不同的免疫反應(yīng)策略來對(duì)抗H.parasuis感染。另外，強(qiáng)毒力菌株感染組的差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄因子、精氨酸酶活性等生物進(jìn)程有關(guān)。弱毒力菌株感染組的差異表達(dá)基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、吞噬體形成等功能有關(guān)。
　　4.差異表達(dá)基因的驗(yàn)證
　　為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，我們利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同信號(hào)通路中的基因，特別是細(xì)胞因子與

7、細(xì)胞因子受體互作通路中基因進(jìn)行了驗(yàn)證。其中包含22個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因，6個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因。熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因的結(jié)果與RNA-seq中差異表達(dá)基因的結(jié)果在趨勢(shì)上基本一致，說明RNA-seq結(jié)果是可靠的。
　　5.IL-19的功能驗(yàn)證
　　通過對(duì)副豬嗜血桿菌感染3D4/21細(xì)胞后IL-19的mRNA和蛋白水平表達(dá)檢測(cè)、siRNA和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和仔豬感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了IL-19與副豬嗜血桿菌病有關(guān)且抑制 IL-1α和