2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是全世界養(yǎng)豬業(yè)出現(xiàn)的導致新生仔豬死亡的主要病原之一,近年來,副豬嗜血桿菌桿菌病已經(jīng)給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。HPS可作為一種常在菌定殖在豬體的上呼吸道,但是在特定條件下可以侵入機體并且導致嚴重的全身性疾病,以纖維素性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征,但是參與全身感染的毒力因子及其致病機制仍舊沒有研究清楚。
   自轉(zhuǎn)運蛋白是革蘭氏陰性菌V型分泌系統(tǒng)分泌的蛋白,研究

2、發(fā)現(xiàn)它可以抑制細胞的吞噬作用以及抵抗補體介導的殺傷,幫助菌體克服宿主的天然免疫。HPS中已發(fā)現(xiàn)與毒力相關的三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白(VtaA),發(fā)現(xiàn)其在HPS中表現(xiàn)出多樣性,并且是很好的疫苗候選抗原。
   為了研究自轉(zhuǎn)運蛋白在抵抗補體介導的殺傷即血清抗性方面可能起到的作用,本論文以副豬嗜血桿菌SH0165中發(fā)現(xiàn)的自轉(zhuǎn)運蛋白基因at2為研究對象,將at2基因進行缺失,然后利用野生菌株和基因缺失株一同進行血清殺菌試驗,來探究at2基因在H

3、PS血清抗性中的作用。具體內(nèi)容如下:
   1電轉(zhuǎn)化法篩選at2-pd基因缺失株
   根據(jù)同源重組的原理將at2基因的passenger domain即at2-pd基因的上下游同源臂連接到溫敏質(zhì)粒pSHK3TS上,將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入副豬嗜血桿菌SH0165中,利用溫敏質(zhì)粒在30℃復制而在41℃不復制的特性,調(diào)節(jié)溫度控制質(zhì)粒的復制,達到篩選缺失株的目的。此方法只得到了發(fā)生單交換的菌株,沒有篩選到發(fā)生第二次單交換的基因缺失株

4、。
   2表達純化AT2-PD蛋白,體外加入蛋白進行血清殺菌試驗
   用SH0165和HPS標準血清型7型菌株(HS1073)一同進行血清殺菌試驗,發(fā)現(xiàn)SH0165具有血清抗性,而HS1073很容易被血清殺傷。試圖用HS1073來充當基因缺失株的角色,體外加入AT2-PD進行血清殺菌試驗。利用at2-pd表達菌株表達AT2-PD蛋白并將表達出的65 KDa大小的蛋白進行純化。在沒有血清抗性的HS1073與5%健康豬血

5、清進行血清殺菌試驗時加入40μg/mL的AT2-PD蛋白一同作用,從體外加入蛋白方面來闡述AT2-PD在血清抗性方面的作用。最終試驗結(jié)果說明體外加入AT2-PD蛋白能夠顯著提高HS1073抵抗血清殺傷的能力。但是此試驗方法存在其不足之處,需繼續(xù)篩選基因缺失株來明確試驗結(jié)果。
   3改變方法篩選at2基因缺失株
   嘗試接合轉(zhuǎn)移的方法進行篩選:將at2-pd基因上下游同源臂連接到自殺性質(zhì)粒pRE112上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

6、入其受體菌大腸桿菌x7213中,x7213和SH0165進行接合轉(zhuǎn)移,利用Cm抗性平皿進行篩選。經(jīng)過多次接合轉(zhuǎn)移均未成功,后試驗驗證cm抗性基因不能在SH0165中發(fā)揮作用,故放棄此篩選方法。
   最后采用自然轉(zhuǎn)化方法進行篩選:將at2基因上下游同源臂兩端加上USS序列(ACCGCTTGT),上游和下游同源臂中間連接gm抗性片段,命名為UGD,將UGD片段連接到自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB上,重組質(zhì)粒與41株HPS菌株進行

7、自然轉(zhuǎn)化,利用Gm抗性進行篩選。最終得到了兩株at2基因缺失株:CF7066-△at2和WH7111-2-△at2,經(jīng)過PCR、Western blot和Southern blot等方法鑒定at2基因的缺失。
   4用at2基因缺失株和野生菌株進行血清殺菌試驗
   得到了at2基因缺失株后,用CF7066和CF7066-△at2一同與90%的健康豬血清進行血清殺菌試驗,試驗結(jié)果表明與SH0165相比,副豬嗜血桿菌CF

8、7066野生菌株抵抗血清殺傷的能力較弱,并且基因缺失株和野生菌株存活率并沒有顯著的差異,說明at2基因在CF7066菌株的血清抗性方面沒有發(fā)揮作用。
   綜上所述,對于HPS基因缺失的方法經(jīng)過了長時間的摸索,最終利用自然轉(zhuǎn)化法得到了CF7066和WH7111-2的at2基因缺失株;篩選到缺失株之前,體外加入AT2-PD蛋白后HS1073抵抗血清殺傷的能力有顯著提高,這說明at2基因與HPS的血清抗性相關,但此試驗存在其不足之處

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