血清5型、13型副豬嗜血桿菌二價(jià)滅活苗研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏病，由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPs)所引起豬的漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的內(nèi)源性繼發(fā)感染性疾病。近些年，隨著全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病在豬病的發(fā)生中起著越來(lái)越重要的作用，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本課題對(duì)近兩年從四川地區(qū)所分離的HPs菌株，進(jìn)行了HPs疫苗用菌株的篩選、疫苗用菌株的生長(zhǎng)特性和HPs二價(jià)滅活苗的研究，為四川地區(qū)副豬嗜血桿菌病的基礎(chǔ)研究、預(yù)防和控制奠定基礎(chǔ)。主要研究

2、內(nèi)容如下:
　　1.HPs疫苗用菌株的篩選
　　選擇四川HPs流行優(yōu)勢(shì)血清型5型、13型分離株，作為HPs疫苗篩選菌株。首先，根據(jù)各分離株來(lái)源地豬的飼養(yǎng)管理、發(fā)病情況和臨床癥狀等，選擇4株血清5型分離株和4株血清13型分離株作為疫苗制備初步候選菌株。然后，根據(jù)小白鼠感染實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各菌株的毒力與免疫原性，從中分別選出毒力較強(qiáng)，免疫原性較好的2株，即血清5型分離株MC-203株、GA-502株和血清13型分離株XJ-103株、M

3、S-301株。最后，根據(jù)仔豬感染實(shí)驗(yàn)，最終篩選出毒力較強(qiáng)，免疫原性較好HPs分離株MC-203株（血清5型）和XJ-103株（血清13型）作為HPs疫苗候選菌株。
　　2.HPs疫苗候選株的生長(zhǎng)特性研究
　　進(jìn)行HPs疫苗候選株MC-203株（血清5型）和XJ-103株（血清13型）的生長(zhǎng)特性研究。首先，篩選了HPs生長(zhǎng)所需的固體培養(yǎng)基;結(jié)果，HPs在TSA上生長(zhǎng)最好，培養(yǎng)18h左右就能長(zhǎng)出。其次，優(yōu)化了影響HPs生長(zhǎng)的NA

4、D濃度和犢牛血清濃度;結(jié)果，HPs在含有15μg/ml的NAD、5％小牛血清的TSB中生長(zhǎng)最好。最后，測(cè)定了疫苗候選株MC-203株和XJ-103株在TSB中的生長(zhǎng)曲線;結(jié)果，二者在培養(yǎng)10-14h時(shí)菌液中活菌數(shù)達(dá)到最大值，隨后開(kāi)始逐漸下降并趨于穩(wěn)定。
　　3.血清5型、13型HPs二價(jià)滅活苗研究
　　3.1二價(jià)滅活苗制備
　　將MC-203株和XJ-103株于TSB中復(fù)蘇，劃線接種于TSA上并連續(xù)傳代三次后，挑取單菌

5、落于TSB中，置于37℃、220r/min的空氣搖床中培養(yǎng)12h左右，收集菌液。用0.2％的甲醛分別對(duì)兩種菌液滅活20h，分別用PBS洗滌并濃縮為1.0×1010個(gè)/ml，將MC-203株菌液、XJ-103株菌液和佐劑（鋁膠）按1∶1∶2的比例混合均勻，即成血清5型、13型HPs二價(jià)滅活苗。滅活苗為混懸液，置于2-8℃冰箱保存。
　　3.2 HPs二價(jià)滅活苗檢驗(yàn)
　　3.2.1無(wú)菌檢驗(yàn)
　　吸取一定量的二價(jià)滅活苗放入無(wú)

6、菌試管中，培養(yǎng)24h后，觀察疫苗中有無(wú)細(xì)菌的生長(zhǎng);結(jié)果，疫苗的性狀沒(méi)有變化，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。吸取少量的滅活苗均勻涂布于TSA上，培養(yǎng)24h后，觀察培養(yǎng)基上有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng);結(jié)果，TSA上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。表明，所制備的HPs二價(jià)滅活是無(wú)菌的。
　　3.2.2安全性檢驗(yàn)
　　用已制備的滅活苗免疫14日齡哺乳仔豬和30-35日齡斷奶仔豬各5頭，每頭豬注射2ml，同時(shí)設(shè)立未免對(duì)照組。通過(guò)觀察其接種后的精神狀態(tài)、呼吸和食欲等，評(píng)價(jià)所制的二價(jià)滅活苗

7、的安全性。結(jié)果表明，接種后所有豬的精神狀態(tài)良好，呼吸、食欲正常;表明，所制備的HPs二價(jià)滅活苗免疫仔豬是安全的。
　　3.3 HPs二價(jià)滅活苗免疫效力研究
　　3.3.1免疫抗體水平測(cè)定
　　用制備的HPs二價(jià)滅活苗免疫14日齡哺乳仔豬測(cè)定其抗體水平，免疫5頭，每頭豬注射2ml，同時(shí)設(shè)立未免對(duì)照組。分別于首次免疫后第7、14、28、56、84、112、140、168、196天采血，用ELISA試劑盒檢測(cè)HPs抗體。結(jié)果

8、，免疫后第14天可檢測(cè)到HPs陽(yáng)性抗體;第84天HPs抗體水平達(dá)到峰值，第196天的血清中仍可以檢測(cè)到HPs抗體。表明，所制備的HPs二價(jià)滅活苗免疫仔豬后能夠產(chǎn)生較好的抗體水平。
　　3.3.2免疫保護(hù)效力研究
　　分別用制備的滅活苗、進(jìn)口商品滅活苗和國(guó)產(chǎn)商品滅活苗免疫30-35日齡仔豬，研究HPs二價(jià)滅活苗的免疫保護(hù)效力。每種滅活苗免疫5頭仔豬，首免3周后二免，同時(shí)設(shè)立未免對(duì)照組。二免后2周，分別用6.8×109CFU的M