人乳寡糖LSTa和血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重復(fù)單元的化學(xué)酶法合成研究.pdf

1、本論文包括人乳寡糖LSTa和血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重復(fù)單元兩類糖鏈的化學(xué)酶法合成研究。
　　1.人乳寡糖LSTa的化學(xué)酶法合成
　　人乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是天然存在于人乳中的一類由2-10個(gè)單糖分子組成的低聚糖，在母乳中的含量較高，僅次于乳糖和脂肪，尤其是在初乳中可達(dá)20-25 g/L。HMOs對(duì)嬰兒消化系統(tǒng)的早期發(fā)育，及出生后免疫系統(tǒng)的完善和體內(nèi)生態(tài)平衡的建立發(fā)揮

2、著不可替代的作用，被譽(yù)為“第一益生元”。已有研究表明人乳寡糖的生物學(xué)功能包括維護(hù)腸道菌群平衡的益生元作用，抑制病原菌感染、病毒和腫瘤細(xì)胞的入侵，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和促進(jìn)新生兒大腦的早期發(fā)育等，因而HMOs的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制研究成為近年來(lái)糖領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　目前，已經(jīng)確定的人乳寡糖的結(jié)構(gòu)有100多種，它們有著共同的核心結(jié)構(gòu):乳-N-四糖(Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，LNT)。人乳寡糖的絕大部分組分都是以乳

3、-N-四糖為核心結(jié)構(gòu)，通過(guò)在其不同羥基上進(jìn)行唾液酸化和（或）巖藻糖糖基化衍生而構(gòu)成了人乳寡糖非常復(fù)雜的糖庫(kù)。鑒于人乳寡糖重要的生物學(xué)意義，獲得足夠量結(jié)構(gòu)均一的人乳寡糖單體來(lái)開(kāi)展它們的生物學(xué)功能研究以及開(kāi)發(fā)其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，如人工配方奶粉等方面的應(yīng)用是現(xiàn)階段迫切需要解決的問(wèn)題。化學(xué)合成是獲得結(jié)構(gòu)確定寡糖的可靠方法，近年來(lái)陸續(xù)出現(xiàn)了一些關(guān)于乳-N-四糖化學(xué)合成的報(bào)道，但其步驟繁多，操作條件要求嚴(yán)格，并且總收率很低，難以達(dá)到大量合成并

4、用于其生物學(xué)功能研究的目的。同時(shí)也出現(xiàn)了很多酶法，化學(xué)酶法及微生物代謝工程等合成方法，但是所需的酶大都來(lái)源于哺乳動(dòng)物，存在表達(dá)量低、底物適應(yīng)性窄、分離純化復(fù)雜等問(wèn)題，因此亟待發(fā)展一種實(shí)用、高效的乳-N-四糖的合成策略。本論文成功發(fā)展了一個(gè)來(lái)自于雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）的D-半乳糖-1-3-N-乙酰-D-己糖胺磷酸化酶(BiGalHexNAcP)和來(lái)自于大腸桿菌(E.coli)的重組半乳糖激酶(EcGa

5、lK)催化的一鍋雙酶反應(yīng)策略來(lái)合成Galβ1-3GlcNAc二糖砌塊。再將其與化學(xué)合成的乳糖苷通過(guò)化學(xué)糖苷化成功高效地合成了人乳寡糖的核心結(jié)構(gòu)乳-N-四糖。乳-N-四糖作為底物可以進(jìn)一步利用“一釜多酶”合成體系對(duì)其進(jìn)行唾液酸化，成功合成了人乳中最常見(jiàn)的唾液酸化乳-N-四糖（Sialyllacto-N-tetraose a，LSTa）。乳-N-四糖作為核心結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵砌塊還可以作為底物來(lái)合成其它眾多唾液酸化或者巖藻糖化的人乳寡糖，這些工作還

6、有待于今后進(jìn)一步完善。
　　本研究取得的主要成果包括以下幾方面:
　　(1)我們完成了乳糖苷受體的區(qū)域選擇性保護(hù)，實(shí)現(xiàn)了匯聚糖苷化的高收率合成，為其他人乳寡糖的合成提供中間體和借鑒意義。
　　(2)我們運(yùn)用“一鍋雙酶”法成功實(shí)現(xiàn)了人乳寡糖核心結(jié)構(gòu)乳-N-四糖在克級(jí)水平上的快速、高效合成;所得的乳-N-四糖作為底物在“一鍋三酶”催化體系下成功實(shí)現(xiàn)了唾液酸化乳-N-四糖(LSTa)的高效、大量合成;
　　(3)我們把

7、化學(xué)修飾的底物應(yīng)用于酶法合成，把酶法合成的砌塊應(yīng)用于化學(xué)合成，再把化學(xué)合成的砌塊作為底物應(yīng)用于酶法合成，充分應(yīng)用了酶法合成高效性、選擇性的優(yōu)勢(shì)又糅合化學(xué)合成的靈活性，實(shí)現(xiàn)了化學(xué)和酶法的高效、有機(jī)結(jié)合;
　　2.血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重復(fù)單元的化學(xué)酶法合成
　　副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中一種沒(méi)有運(yùn)動(dòng)性的小型多形態(tài)桿菌，革蘭氏染色呈陰性，?？梢?jiàn)莢膜。副豬嗜血桿菌

8、病是由副豬嗜血桿菌引起的一種以纖維素性漿膜炎，多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，胸膜炎和腦膜炎為特征的豬呼吸道傳染病，嚴(yán)重危害各年齡段的豬群，病死率較高。近年來(lái)，該病成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌血清型復(fù)雜多樣，至少有15種血清型，不同血清型副豬嗜血桿菌之間的致病力差異較大。從世界范圍內(nèi)來(lái)看，血清4、5型最為流行，而Hps的毒力因子仍不清楚。Hps有莢膜多糖(Capsular polysaccharide，C

9、PS)抗原和菌體結(jié)構(gòu)抗原。莢膜抗原成分主要是多糖和磷壁酸，具有血清型特異性;菌體結(jié)構(gòu)抗原包括外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)和脂多糖(LPS)。其中莢膜多糖和脂多糖在細(xì)菌感染寄主細(xì)胞時(shí)發(fā)揮重要的作用，雖然相關(guān)研究很多，但是具體的致病機(jī)制也還不清楚。
　　隨著研究的發(fā)展，血清型5和15的莢膜多糖和脂多糖結(jié)構(gòu)剛剛確定，特別是流行最廣、毒性最強(qiáng)的血清型5莢膜多糖的結(jié)構(gòu)研究吸引了人們極大的關(guān)注，期待對(duì)其

10、潛在毒力因子的結(jié)構(gòu)功能鑒定和致病機(jī)制提供基礎(chǔ)導(dǎo)向性的理論研究。血清型5的莢膜多糖重復(fù)單元確定為Neu5Ac/Neu5Gcα2-3Galα1-P-6Glcβ1-3-Sugar(2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxy-D-galactopyranose)，該分子結(jié)構(gòu)新穎、奇特，目前還沒(méi)有相關(guān)的合成報(bào)道。我們從甘露糖通過(guò)多步反應(yīng)首先得到細(xì)菌中普遍存在的脫氧糖受體，然后利用不同的葡萄糖苷給體根據(jù)不同的催化體系高效的合成目標(biāo)

11、四糖還原端的核心二糖砌塊一。同時(shí)利用“一鍋三酶”催化體系分別合成Neu5Acα2-3 Gal/Neu5 Gcα2-3 Gal，再經(jīng)化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為非還原端修飾的二糖砌塊二。將兩個(gè)二糖砌塊通過(guò)磷酸二酯鍵連接、再經(jīng)脫保護(hù)成功得到了目標(biāo)四糖重復(fù)單元。本研究為新型副豬嗜血桿菌高效廣譜的疫苗研制奠定了一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　本研究取得的主要成果包括以下幾方面:
　　(1)我們首次成功發(fā)展了一種化學(xué)酶法合成血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重

12、復(fù)單元的方法，為研究副豬嗜血桿菌的毒力因子和致病機(jī)制提供了非常重要的活性體和結(jié)構(gòu)功能研究的依據(jù)。
　　(2)我們首次化學(xué)酶法合成唾液酸和磷酸酯共存的罕見(jiàn)分子結(jié)構(gòu)，該合成方法將成為未來(lái)類似寡糖合成工作中的一個(gè)強(qiáng)有力策略。
　　(3)我們首次化學(xué)合成了半乳糖通過(guò)磷酸酯連接葡萄糖6位的新穎寡糖分子。
　　(4)實(shí)現(xiàn)了多種葡萄糖苷給體和含雙疊氮基團(tuán)脫氧糖受體的多種有效結(jié)合的摸索和嘗試。
　　(5)實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌中常見(jiàn)脫氧糖的