人乳寡糖LSTa和血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重復單元的化學酶法合成研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本論文包括人乳寡糖LSTa和血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重復單元兩類糖鏈的化學酶法合成研究。
  1.人乳寡糖LSTa的化學酶法合成
  人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是天然存在于人乳中的一類由2-10個單糖分子組成的低聚糖,在母乳中的含量較高,僅次于乳糖和脂肪,尤其是在初乳中可達20-25 g/L。HMOs對嬰兒消化系統(tǒng)的早期發(fā)育,及出生后免疫系統(tǒng)的完善和體內生態(tài)平衡的建立發(fā)揮

2、著不可替代的作用,被譽為“第一益生元”。已有研究表明人乳寡糖的生物學功能包括維護腸道菌群平衡的益生元作用,抑制病原菌感染、病毒和腫瘤細胞的入侵,調節(jié)免疫反應和促進新生兒大腦的早期發(fā)育等,因而HMOs的生物學功能及其作用機制研究成為近年來糖領域的熱點。
  目前,已經確定的人乳寡糖的結構有100多種,它們有著共同的核心結構:乳-N-四糖(Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc,LNT)。人乳寡糖的絕大部分組分都是以乳

3、-N-四糖為核心結構,通過在其不同羥基上進行唾液酸化和(或)巖藻糖糖基化衍生而構成了人乳寡糖非常復雜的糖庫。鑒于人乳寡糖重要的生物學意義,獲得足夠量結構均一的人乳寡糖單體來開展它們的生物學功能研究以及開發(fā)其在食品和醫(yī)藥領域的應用,如人工配方奶粉等方面的應用是現階段迫切需要解決的問題?;瘜W合成是獲得結構確定寡糖的可靠方法,近年來陸續(xù)出現了一些關于乳-N-四糖化學合成的報道,但其步驟繁多,操作條件要求嚴格,并且總收率很低,難以達到大量合成并

4、用于其生物學功能研究的目的。同時也出現了很多酶法,化學酶法及微生物代謝工程等合成方法,但是所需的酶大都來源于哺乳動物,存在表達量低、底物適應性窄、分離純化復雜等問題,因此亟待發(fā)展一種實用、高效的乳-N-四糖的合成策略。本論文成功發(fā)展了一個來自于雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)的D-半乳糖-1-3-N-乙酰-D-己糖胺磷酸化酶(BiGalHexNAcP)和來自于大腸桿菌(E.coli)的重組半乳糖激酶(EcGa

5、lK)催化的一鍋雙酶反應策略來合成Galβ1-3GlcNAc二糖砌塊。再將其與化學合成的乳糖苷通過化學糖苷化成功高效地合成了人乳寡糖的核心結構乳-N-四糖。乳-N-四糖作為底物可以進一步利用“一釜多酶”合成體系對其進行唾液酸化,成功合成了人乳中最常見的唾液酸化乳-N-四糖(Sialyllacto-N-tetraose a,LSTa)。乳-N-四糖作為核心結構和關鍵砌塊還可以作為底物來合成其它眾多唾液酸化或者巖藻糖化的人乳寡糖,這些工作還

6、有待于今后進一步完善。
  本研究取得的主要成果包括以下幾方面:
  (1)我們完成了乳糖苷受體的區(qū)域選擇性保護,實現了匯聚糖苷化的高收率合成,為其他人乳寡糖的合成提供中間體和借鑒意義。
  (2)我們運用“一鍋雙酶”法成功實現了人乳寡糖核心結構乳-N-四糖在克級水平上的快速、高效合成;所得的乳-N-四糖作為底物在“一鍋三酶”催化體系下成功實現了唾液酸化乳-N-四糖(LSTa)的高效、大量合成;
  (3)我們把

7、化學修飾的底物應用于酶法合成,把酶法合成的砌塊應用于化學合成,再把化學合成的砌塊作為底物應用于酶法合成,充分應用了酶法合成高效性、選擇性的優(yōu)勢又糅合化學合成的靈活性,實現了化學和酶法的高效、有機結合;
  2.血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重復單元的化學酶法合成
  副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)是巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中一種沒有運動性的小型多形態(tài)桿菌,革蘭氏染色呈陰性,??梢娗v膜。副豬嗜血桿菌

8、病是由副豬嗜血桿菌引起的一種以纖維素性漿膜炎,多發(fā)性關節(jié)炎,胸膜炎和腦膜炎為特征的豬呼吸道傳染病,嚴重危害各年齡段的豬群,病死率較高。近年來,該病成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的典型細菌性疾病,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。副豬嗜血桿菌血清型復雜多樣,至少有15種血清型,不同血清型副豬嗜血桿菌之間的致病力差異較大。從世界范圍內來看,血清4、5型最為流行,而Hps的毒力因子仍不清楚。Hps有莢膜多糖(Capsular polysaccharide,C

9、PS)抗原和菌體結構抗原。莢膜抗原成分主要是多糖和磷壁酸,具有血清型特異性;菌體結構抗原包括外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)和脂多糖(LPS)。其中莢膜多糖和脂多糖在細菌感染寄主細胞時發(fā)揮重要的作用,雖然相關研究很多,但是具體的致病機制也還不清楚。
  隨著研究的發(fā)展,血清型5和15的莢膜多糖和脂多糖結構剛剛確定,特別是流行最廣、毒性最強的血清型5莢膜多糖的結構研究吸引了人們極大的關注,期待對其

10、潛在毒力因子的結構功能鑒定和致病機制提供基礎導向性的理論研究。血清型5的莢膜多糖重復單元確定為Neu5Ac/Neu5Gcα2-3Galα1-P-6Glcβ1-3-Sugar(2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxy-D-galactopyranose),該分子結構新穎、奇特,目前還沒有相關的合成報道。我們從甘露糖通過多步反應首先得到細菌中普遍存在的脫氧糖受體,然后利用不同的葡萄糖苷給體根據不同的催化體系高效的合成目標

11、四糖還原端的核心二糖砌塊一。同時利用“一鍋三酶”催化體系分別合成Neu5Acα2-3 Gal/Neu5 Gcα2-3 Gal,再經化學反應將其轉化為非還原端修飾的二糖砌塊二。將兩個二糖砌塊通過磷酸二酯鍵連接、再經脫保護成功得到了目標四糖重復單元。本研究為新型副豬嗜血桿菌高效廣譜的疫苗研制奠定了一定的結構基礎。
  本研究取得的主要成果包括以下幾方面:
  (1)我們首次成功發(fā)展了一種化學酶法合成血清型5副豬嗜血桿菌莢膜多糖重

12、復單元的方法,為研究副豬嗜血桿菌的毒力因子和致病機制提供了非常重要的活性體和結構功能研究的依據。
  (2)我們首次化學酶法合成唾液酸和磷酸酯共存的罕見分子結構,該合成方法將成為未來類似寡糖合成工作中的一個強有力策略。
  (3)我們首次化學合成了半乳糖通過磷酸酯連接葡萄糖6位的新穎寡糖分子。
  (4)實現了多種葡萄糖苷給體和含雙疊氮基團脫氧糖受體的多種有效結合的摸索和嘗試。
  (5)實現了細菌中常見脫氧糖的

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