副豬嗜血桿菌基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建與其莢膜多糖輸出蛋白基因的篩選和免疫原性研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌病已成為嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一種重要細(xì)菌病。目前對(duì)該病原的研究特別是其致病與免疫機(jī)理的研究尚處于起步階段。進(jìn)行副豬嗜血桿菌致病與免疫機(jī)理的研究，對(duì)于該病的預(yù)防、診斷和控制具有重要意義。本研究以副豬嗜血桿菌SC-1四川分離株為材料，構(gòu)建其基因組表達(dá)文庫，并對(duì)該菌的體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因進(jìn)行篩選，并進(jìn)一步對(duì)已篩選的副豬嗜血桿菌莢膜多糖輸出蛋白基因進(jìn)行免疫原性的研究。研究內(nèi)容如下：
　　 1.副豬嗜血桿菌SC-1株基因組表達(dá)文庫

2、的構(gòu)建研究本研究以血清4型副豬嗜血桿菌SC-1四川分離株為材料，按照常規(guī)分子克隆手段構(gòu)建其基因組表達(dá)文庫。采用SDS-蛋白酶K法提取副豬嗜血桿菌SC-1株基因組DNA，獲得了高質(zhì)量的基因組DNA。用Sau3AⅠ酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，優(yōu)化酶量及其作用時(shí)間，結(jié)果表明用0.25μL的酶于37℃，酶切2.5μg基因組DNA1h，產(chǎn)生的500bp～2000bp片段效果最佳。按此條件大量酶切基因組DNA并回收純化500bp～2000bp左右的片段。同

3、時(shí)，用BamHI分別酶切原核表達(dá)載體pRSETA、pRSETB、pRSETC，并對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化。將基因組片段與去磷酸化處理的表達(dá)載體pRSETA/B/C連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR結(jié)果表明外源插入片段大小范圍在500bp～2000bp之間，插入率達(dá)到80％以上；大量提取轉(zhuǎn)入DH5a中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得轉(zhuǎn)化子達(dá)1.2×105CFU，即副豬嗜血桿菌基因組表達(dá)文庫的

4、庫容量為1.2×105CFU。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明：外源插入片段均為副豬嗜血桿菌基因組片段，與副豬嗜血桿菌(SH1065,CP001321.1)序列同源性高達(dá)99％以上。上述結(jié)果表明成功構(gòu)建了血清4型副豬嗜血桿菌基因組表達(dá)文庫，為篩選副豬嗜血桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.副豬嗜血桿菌SC-1株體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因的初步篩選及鑒定研究在構(gòu)建的副豬嗜血桿菌SC-1株基因組表達(dá)文庫的基礎(chǔ)上，用人工

5、感染副豬嗜血桿菌制備的陽性血清對(duì)其基因組表達(dá)文庫進(jìn)行體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因的免疫篩選及鑒定。用體外培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌SC-1株和BL21宿主菌及其超聲裂解液、熱變性裂解液依次吸附人工感染的陽性血清，以除去體外培養(yǎng)表達(dá)抗原產(chǎn)生的非特異性抗體亞群。處理過的血清經(jīng)ELISA鑒定表明，隨著吸附的進(jìn)行，血清的D450nm值逐漸下降，直至穩(wěn)定。Westernblot鑒定表明，經(jīng)過多次吸附后的血清中不再含有針對(duì)體外培養(yǎng)表達(dá)抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。以此血清對(duì)表達(dá)

6、文庫進(jìn)行了三次免疫篩選，最終獲得5個(gè)陽性菌落。5個(gè)陽性菌落經(jīng)過核苷酸序列測(cè)定，表明外源插入片段與GenBank公布的副豬嗜血桿菌基因組序列同源性達(dá)99％以上。針對(duì)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性擴(kuò)增外源插入片段的引物，抽提體外培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌的mRNA，進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明上述基因在體外不發(fā)生轉(zhuǎn)錄，副豬嗜血桿菌SC-1株體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因篩選成功。用OFRFinder分析外源插入片段，發(fā)現(xiàn)5個(gè)可能具有生物學(xué)意義的ORF;該ORF序列用BL

7、AST與副豬嗜血桿菌基因組序列比對(duì)，分別涉及酪氨酸磷酸酯酶基因(IVI-1)、異亮氨酰-tRNA合成酶基因(IVI-2)、莢膜多糖輸出蛋白基因(IVI-3)及2個(gè)假定蛋白基因（IVI-4、IVI-5）；通過DNAstar軟件分析5個(gè)開放閱讀框的抗原性，表明其編碼產(chǎn)物均存在多個(gè)抗原位點(diǎn)。其中莢膜多糖輸出蛋白基因的成功篩選和鑒定，為進(jìn)一步研究其免疫原性研究打下了基礎(chǔ)。
　　 3.副豬嗜血桿菌SC-1株莢膜多糖輸出蛋白的克隆表達(dá)及免疫

8、原性初步研究以莢膜多糖輸出蛋白基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其進(jìn)行免疫原性研究。根據(jù)提交NCBI的莢膜多糖輸出蛋白基因(IVI-3,CPEP)序列（GenBank登錄號(hào)為HM063414）設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)其全基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-CPEP。表達(dá)質(zhì)粒pET32a-CPEP經(jīng)過菌落PCR及雙酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株。用IPTG誘導(dǎo)宿主菌獲得表達(dá)，SDS-PAGE分析表明重組莢膜多糖輸出蛋白分子量約為35

9、kD。同時(shí)對(duì)IPTG工作濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，確定獲得最高表達(dá)量的條件為：IPTG最佳工作濃度為終濃度1.0mM，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5h。用豬抗副豬嗜血桿菌陽性血清對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，在35kD處出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶，表明重組莢膜多糖輸出蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　 將純化的重組莢膜多糖輸出蛋白蛋白（A組）、副豬嗜血桿菌SC-1全菌滅活抗原(B組)，分別與弗氏佐劑進(jìn)行乳化，分兩次間隔兩周皮下多點(diǎn)接種小鼠，

10、同時(shí)，設(shè)立PBS加佐劑（C組）、PBS（D組）作為對(duì)照。在首免前(0d)以及首免后的14d、28d采集小鼠血清，用ELISA檢測(cè)特異性抗副豬嗜血桿菌的抗體水平。在首免后14d,A組、B組檢測(cè)到特異性抗副豬嗜血桿菌抗體的產(chǎn)生。首免后28d,A組與B組檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生較兩周前抗體水平進(jìn)一步提高，其中B組抗體水平高于A組。C組與D組整個(gè)免疫過程未檢測(cè)到特異性抗副豬嗜血桿菌抗體。上述結(jié)果表明重組莢膜多糖輸出蛋白有一定免疫原性。