應(yīng)用多重PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)區(qū)分偽狂犬病病毒強(qiáng)弱毒和胸膜肺炎放線桿菌血清型2菌株莢膜多糖的初步研究.pdf

1、本研究包括三個(gè)部分。1.偽狂犬病病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由a皰疹病毒科的偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)引起的包括多種家畜和野生動(dòng)物共患的一種嚴(yán)重傳染病。豬是該病毒的天然宿主和貯存者。該病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防、控制和最終根除該病是我國(guó)當(dāng)前面臨的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。 本研究根據(jù)基因庫(kù)中的豬偽狂犬病病毒(PrV)各基因的序列，設(shè)計(jì)了與PrV的gB、

2、gD、gE基因序列互補(bǔ)的3對(duì)引物。對(duì)樣品中的PrVDNA模板進(jìn)行了多重PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化，結(jié)果同時(shí)得到與設(shè)計(jì)相符合的3條特異性條帶，分別為549bp(gB)、429bp(gD)、366bp(gE)。用這3對(duì)引物對(duì)TK-/gI-/gE-三基因缺失疫苗毒的樣品DNA模板進(jìn)行多次多重PCR擴(kuò)增，均能穩(wěn)定得到與設(shè)計(jì)相符合的2條特異性條帶。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，多重PCR可以檢測(cè)到106pg三基因缺失疫苗毒或756pgPrV野毒的核酸模板量

3、。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，以正常對(duì)照細(xì)胞及豬圓環(huán)病毒和豬細(xì)小病毒DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，均無(wú)任何條帶。 2.基因芯片技術(shù)檢測(cè)PrV的研究選取了豬偽狂犬病病毒(PrV)gD，gB，gE基因(gE-，gE)、藍(lán)耳病病毒(PPRSV)ORF6、圓環(huán)病毒Ⅱ(PCV2)ORF2、細(xì)小病毒(PPV)NS1、乙型腦炎病毒(JEV)NS1的保守片段(200-300bp)和作為內(nèi)參的豬源看家基因GAPDH部分片段(250bp)、人β-acti

4、n等片段作為捕獲探針并設(shè)計(jì)了特異性引物，固定在芯片上，制成芯片；編碼PrV野毒株和gE-突變株保守性糖蛋白的gD，gB，gE基因，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、標(biāo)記、變性后雜交到制備的芯片上，結(jié)果表明PrV野毒株和gE-突變株gD，gB均出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)，然而，在gE基因缺失的部位(gF)，PrV野毒株出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)，gE-突變株不出現(xiàn)雜交信號(hào)。PrVPCR產(chǎn)物和PRRSV，JEV，PCV2，PPV的捕獲探針間無(wú)非特異性雜交信號(hào)。

5、芯片能夠最低檢測(cè)出3.24fg的DNA模板，其敏感性至少比普通gD-PCR高10倍。本研究說(shuō)明基因芯片技術(shù)能檢測(cè)偽狂犬病病毒并鑒別野毒與gE-突變株感染。 3.胸膜肺炎放線桿菌莢膜多糖基因的克隆表達(dá)豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(ActinobacillusPleuropneumoniae，App)引起的一種具有高度傳染性的呼吸道疾病，是危害當(dāng)前世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬胸膜肺炎放線桿

6、菌莢膜多糖是該菌的毒力相關(guān)因子，且莢膜多糖的血清型差異及合成的數(shù)量決定了菌毒力大小。本實(shí)驗(yàn)參考豬胸膜肺炎放線桿菌血清型2型莢膜多糖的基因序列(GenbankAY357726)分別設(shè)計(jì)了三對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度分別為1137bp、429bp、1146bp的CpsA、CpsB、CpsC三個(gè)基因片段，然后將其分別克隆到PMD18-T中，經(jīng)酶切鑒定和序列分析獲得了陽(yáng)性克隆子，再將CpsA、CpsB、CpsC分別插入到原核表達(dá)載