副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114株差異分泌蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,Hps）屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是豬上呼吸道的常在菌，該菌引起的感染給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來極大的損失。該菌血清型眾多，毒力因子復雜，到目前為止發(fā)現(xiàn)了一些副豬嗜血桿菌的毒力因子，但針對不同致病力副豬嗜血桿菌分泌蛋白的差異研究報道甚少。本試驗選取兩株不同致病力副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114菌株作為研究對象，比較其生長特性及致病力，采用蛋白質組學技術比較并鑒定其對數(shù)期差異分泌蛋白質，

2、同時利用熒光定量PCR技術分析差異分泌蛋白基因轉錄水平，具體研究內(nèi)容如下:
　　1、副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114株生長特性和致病力的比較
　　本試驗采用比濁法和平板活菌計數(shù)兩種方法測量了Nagasaki和SW114株的生長曲線，結果得知對數(shù)期SW114株生長速度明顯快于Nagasaki株，SW114株穩(wěn)定期持續(xù)時間約為9h，長于Nagasaki株的6h，當OD600=0.6時，兩菌株都處于對數(shù)生長期。以體重20-

3、22g4～8周齡雌性BALB/c小鼠為試驗動物，采用改進寇氏法測Nagasaki和SW114株的半數(shù)致死量，結果Nagasaki株的半數(shù)致死量為3.16×109cfu，SW114株的半數(shù)致死量為2.95×1012cfu，表明Nagasaki株的致病力約為SW114株的1000倍，從而為進一步進行分泌蛋白質組學分析奠定基礎。
　　2、副豬嗜血桿菌Nagasaki和SW114株分泌蛋白的比較蛋白質組學分析
　　采用三氯乙酸(TC

4、A)沉淀法分別提取Nagasaki和SW114株對數(shù)期分泌蛋白，采用雙向電泳技術(two-dimensional(2D) electrophoresis)分離分泌蛋白樣品，結果成功構建了Nagasaki和SW114株37℃培養(yǎng)條件下的分泌蛋白圖譜，經(jīng)PDQuest8.0軟件比較并分析圖譜發(fā)現(xiàn)Nagasaki株分泌蛋白圖譜中有32個蛋白點，SW114菌株分泌蛋白圖譜有25個蛋白點，其中兩張圖譜共有的點有22個，10個蛋白點僅存在于Naga

5、saki株的分泌蛋白圖譜，3個點僅存在于SW114株的分泌蛋白圖譜。從雙向電泳凝膠中挖取這13個差異蛋白點，經(jīng)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry,MALD1-TOF/TOF-MS)鑒定，這13個蛋白點對應12中蛋白，其中10個蛋白僅存在于Nagasaki株的分泌蛋白中，依次

6、為粘附素AidA蛋白、胞外絲氨酸蛋白酶（自轉運體）(771aa)、胞外絲氨酸蛋白酶（自轉運體）(780aa)、表面保護性抗原D15、30 S核糖體蛋白S2、周質絲氨酸蛋白酶、酸性磷酸酶、外膜蛋白、蛋白-二硫化物異構酶、鐵ABC轉運體底物結合蛋白。2個蛋白僅存在于SW114株的分泌蛋白中，依次為C4-二羧酸ABC轉運體底物結合蛋白、肽ABC轉運體底物結合蛋白。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白粘附素AidA蛋白、胞外絲氨酸蛋白酶（自轉運體）(771aa

7、)、胞外絲氨酸蛋白酶（自轉運體）(780aa)與毒力相關，差異蛋白C4-二羧酸ABC轉運體底物結合蛋白和肽ABC轉運體底物結合蛋白與代謝相關。
　　3、副豬嗜血桿菌差異分泌蛋白的基因轉錄水平分析
　　為了探討差異分泌蛋白的基因轉錄水平情況，選取其中三個蛋白:粘附素AidA蛋白、表面保護性抗原D15和鐵ABC轉運體底物結合蛋白，其編碼基因依次為Aida、ompD15和AfuA，通過實時熒光定量PCR方法檢測其在Nagasaki

8、和SW114株的轉錄水平。實驗結果顯示，Aida基因的轉錄水平在Nagasaki株是其在SW114株的3.924倍，ompD15基因的轉錄水平在Nagasaki株是其在SW114株的36.668倍，AfuA基因的轉錄水平在Nagasaki株是其在SW114株的39.606倍，選取的這三個蛋白的基因轉錄水平在Nagasaki株均高于SW114株，轉錄水平和表達水平呈現(xiàn)一致的趨勢。
　　粘附素AidA蛋白、胞外絲氨酸蛋白酶（自轉運體）