遺傳性FXII缺陷癥分子機(jī)制及血小板相關(guān)疾病研究.pdf

1、本研究收集了5個(gè)遺傳性凝血因子Ⅻ(coagulation factorⅫ，F(xiàn)Ⅻ)缺陷癥家系，并對(duì)此開展了臨床表現(xiàn)、家系調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和基因診斷等方面的研究;對(duì)所發(fā)現(xiàn)的3個(gè)導(dǎo)致CRM遺傳性FⅫ缺陷癥的突變位點(diǎn)(c.776G＞A，c.799C＞G，c.1561G＞A)進(jìn)行了突變蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究，以探討三個(gè)突變導(dǎo)致遺傳性FⅫ缺陷癥的分子機(jī)制。此外，本研究探討了血小板膜蛋白GPIbβ胞內(nèi)段調(diào)控GPIbα酶切的分子機(jī)制，并應(yīng)用全外顯子測(cè)序方

2、法對(duì)一例難治性ITP進(jìn)行了基因診斷研究。
　　FⅫ是內(nèi)源凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)因子，遺傳性FⅫ缺陷癥是由編碼FⅫ蛋白的基因F12突變所引起的，是一種常染色體隱性遺傳性疾病，患者無(wú)臨床出血表現(xiàn)，多在術(shù)前凝血篩查中因APTT延長(zhǎng)而發(fā)現(xiàn)。本研究對(duì)發(fā)現(xiàn)的5個(gè)遺傳性FⅫ缺陷癥進(jìn)行了基因診斷和分子機(jī)制研究。5個(gè)先證者FⅫ活性(FⅫ∶C)和抗原(FⅫ∶Ag)均明顯降低，基因診斷發(fā)現(xiàn)了F12基因上存在3種基因突變，分別是c.776G＞A(p.G259E)

3、、c.799C＞G(p.R267G)和c.1561G＞A(p.E521K)，其中c.776G＞A(p.G259E)、c.799C＞G（p.R267G）為國(guó)際首次報(bào)道。針對(duì)發(fā)現(xiàn)的基因突變，構(gòu)建FⅫ突變表達(dá)質(zhì)粒，在體外探討三個(gè)突變導(dǎo)致遺傳性FⅫ缺陷癥的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)外的FⅫ∶Ag均明顯下降，細(xì)胞上清中FⅫ∶C也明顯下降，提示三種突變是導(dǎo)致FⅫ缺陷的原因;Real time PCR結(jié)果顯示三個(gè)FⅫ突變體均能正常轉(zhuǎn)錄;進(jìn)一步蛋白降

4、解抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三個(gè)FⅫ突變體通過(guò)蛋白酶體進(jìn)行降解是導(dǎo)致FⅫ表達(dá)量下降的根本原因;FⅫ突變體和野生型共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞結(jié)果顯示FⅫR267G和FⅫG259E具有dominant negative effect，然而，這種dominant negative effect的產(chǎn)生并不是由于FⅫ突變體和野生型形成雜合二聚體而引起的。
　　GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物是引起血小板活化第一步的受體蛋白，在生理止血中起著重要作用。GPIbo是

5、GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物中最重要的一個(gè)亞基，其酶切在血栓形成過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控的作用，對(duì)于血小板保存及清除也至關(guān)重要。目前對(duì)于GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物中GPIbα酶切調(diào)控機(jī)制仍不明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)的GPIbβ胞內(nèi)近膜端可以通過(guò)與某個(gè)未知蛋白相互作用抑制GPIbα酶切。為明確這個(gè)未知蛋白，我們?cè)诖竽c桿菌中表達(dá)并提純野生型以及關(guān)鍵部位突變(R151E/R152E或R149E/L150E)的GPIbβ胞內(nèi)段蛋白，利用pull-down結(jié)合蛋白質(zhì)

6、譜(MS)的方法，篩選出多種可能與GPIbβ胞內(nèi)段相互作用的蛋白，包括膜突蛋白(moesin)、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)等。
　　免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenia purpura，ITP）是一種獲得性的自身抗體介導(dǎo)的破壞和損害血小板及其再生的血液系統(tǒng)疾病。臨床以皮膚粘膜或內(nèi)臟出血為主要表現(xiàn)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)一例激素治療無(wú)效的難治性ITP患者，為明確其致病因素，我們對(duì)患者外