組蛋白修飾對(duì)pre-mRNA選擇性剪接影響的分子機(jī)制研究——釀酒酵母中選擇性剪接模型的建立及基因表達(dá)水平的檢測(cè).pdf

1、目的:建立釀酒酵母中DYN-2基因選擇性剪接的質(zhì)粒模型，并用SYBR 熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR的方法來檢測(cè)DYN-2基因第二外顯子的相對(duì)表達(dá)含量，研究組蛋白的修飾對(duì)pre-mRNA 選擇性剪接的影響。
　　 方法:在我們之前的工作中，得到了含有DYN-2基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。然后測(cè)序檢測(cè)DYN-2 片段是否正確導(dǎo)入，測(cè)序結(jié)果顯示無(wú)誤后用乙酸鋰法將質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)入到不含質(zhì)粒DNA的空白酵母中，于省卻Trp的培養(yǎng)基中篩選出陽(yáng)性克隆

2、，標(biāo)記為X 酵母。我們進(jìn)一步檢測(cè)了未突變的組蛋白質(zhì)粒DNA，以及含有H3K14A，H3K18A/H4K5A和H4K8A 突變DNA，酶切檢測(cè)所提質(zhì)粒是否正確，結(jié)果無(wú)誤后將突變的質(zhì)粒DNA和未突變的質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)入到X 酵母中，于省卻Trp和Leu 培養(yǎng)基中篩選出陽(yáng)性克隆，并相應(yīng)標(biāo)記為O 酵母、AA 酵母、L酵母和Q 酵母。然后提取O、AA、L、和Q 酵母的總RNA，經(jīng)Dnase I 處理后去除DNA 污染，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃

3、或-80℃保存。設(shè)計(jì)并合成特異性反映DYN-2基因中第二外顯子保留情況的引物，以及作為內(nèi)參的SCR-1基因引物，使用SYBR 熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)各種突變情況下DYN-2基因第二外顯子的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:本文建立了組蛋白修飾對(duì)pre-mRNA 選擇性剪接影響的體外研究模型，使用酵母雙雜交系統(tǒng)將模型基因和組蛋白突變基因?qū)胪唤湍讣?xì)胞內(nèi)，并用RT-reAltime PCR 方法檢測(cè)不同的突變對(duì)模型質(zhì)粒上DYN-2

4、基因的剪接影響。以SYBR 熒光染色法能夠反映小基因DYN-2小基因模型第二外顯保留/切除的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組蛋白突變組相對(duì)于未突變組，第二外顯子保留/切除的量均有下降。
　　 結(jié)論:體外構(gòu)建的組蛋白修飾對(duì)選擇性剪接的影響模型，可更為直接有效的反映組蛋白修飾的變化對(duì)選擇性剪接的影響；實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)目的基因選擇性剪接狀況的測(cè)定準(zhǔn)確，可作為選擇性剪接研究的實(shí)用方法；組蛋白上賴氨酸的突變可能會(huì)對(duì)DYN-2基因的選擇性剪接