甲狀腺激素受體βpre-mRNA新剪接方式體外蛋白水平的研究.pdf

1、甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor,TR)屬于核受體超家族的成員,廣泛分布在各種組織中。甲狀腺激素通過與甲狀腺激素受體結合,作用于轉錄過程實現(xiàn)其對靶基因的正性/負性調節(jié),對于機體的正常分化發(fā)育和代謝平衡具有十分重要的作用。TR存在2種主要的亞型:TRα和TRβ。而由于轉錄起始點以及剪切方式的不同,每種亞型又包括若干同功體(isoforms)。主要的有TRα1、TRα2、TRα3、TR△α1、TR△α2、TR

2、β1、TRβ2、TRβ3、TR△β3等。我們新發(fā)現(xiàn)的TRβ△亞型,在外顯子3、4之間多出了一個外顯子N(Novel),產(chǎn)生了一種新的剪接方式,本文將在大鼠肝細胞中對兩種剪接方式的關系進行研究。
　　 構建重組質粒:以PCR的方法獲得目的片段Luciferage、EGFP、cDNA3N4、cDNA34及Minigene。利用限制性酶切位點,構建重組質粒pcDNA3.1(+)/Luciferage、pcDNA3.1(+)/EGFP、

3、pcDNA3.1(+)/cDNA3N4-Luciferase、pcDNA3.1(+)/cDNA3N4-EGFP、pcDNA3.1(+)/cDNA34-Luciferage、pcDNA3.1(+)/cDNA34-EGFP、pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferage及pcDNA3.1(+)/Minigene-EGFP。重組質粒經(jīng)酶切鑒定及測序鑒定,證實構建成功。
　　 突變重組質粒:利用體外定點突變技術,在構建好

4、的重組質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferage、pcDNA3.1(+)/Minigene-EGFP的外顯子N區(qū)域缺失一個堿基,突變?yōu)橹亟M質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-Luciferase、pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-EGFP;又在重組質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-Luciferage、pcDNA3.1(+)/Minigene-Nd

5、ell-EGFP的外顯子4區(qū)域缺失兩個堿基,突變?yōu)橹亟M質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-4del2-Luciferase、pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-4del2-EGFP。突變質粒經(jīng)測序鑒定,證實構建成功。
　　 體外轉染:培養(yǎng)大鼠肝細胞BRL,將構建好的重組質粒以相同摩爾數(shù)轉染BRL細胞,48個小時后,RT-PCRR擴增轉錄本,熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光,并運用統(tǒng)計學軟件分析

6、熒光素酶的活性值。小基因重組質粒逆轉錄的結果擴增出兩條帶,說明在在大鼠肝細胞BRL中,兩種剪接方式都存在；綠色熒光的觀察顯示,轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-EGFP的細胞,視野中可見多處綠色熒光,轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-EGFP的細胞,視野中幾乎找不到綠色熒光,轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Ndell-4del2-EGFP的細胞視野中可見多處綠色熒光；分析熒光

7、素酶的活性值的結果表明,轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferase的細胞與轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Nde11-Luciferase的細胞,熒光素酶的活性值差別有統(tǒng)計學意義(p<0.05),轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Nde11-4de12-Luciferase的細胞與轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Nde11-Luciferase的細胞,熒光素

8、酶的活性值差別有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；而轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene-Luciferase的細胞與轉染質粒pcDNA3.1(+)/Minigene--Nde11-4de12-Luciferase的細胞差別熒光素酶的活性值沒有統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　 綜上結果表明,所構建的小基因模型在大鼠肝細胞中,可以剪接成兩種轉錄本,其中剪接方式形成外顯子3N4時產(chǎn)生綠色熒光和熒光的酶活性值都要明顯高于剪接方